Анализ уровня аллельной нагрузки соматической мутацией С. 1849 G>T V617F в гене JAK2 с помощью программного обеспечения Kminor Variant Finderl

Введение. Соматические мутации в опухолевых клетках могут служить диагностическими и прогностическими маркерами,а также определять чувствительность к противораковым препаратам. Известно,что при использовании метода Сэнгера для анализа соматических му- таций существуют проблемы,связанные как с количественной оценкой уровня присутствия мутантного аллеля (что важно при онкогема-тологических патологиях), так и с интерпретацией результатов в образцах ДНК с уровнем нагрузки мутантным аллелем менее 15–20 %.

В тоже время достаточно часто, в том числе и при онкогематологических заболеваниях соматические мутации (драйверные или ассоциированные с неблагоприятным прогнозом течения заболевания) присутствуют в небольшом количестве исследуемых аллелей. Это диктует необходимость использования более чувствительных молекулярно-генетических методов или дополнительного программного обеспечения (ПО). Новое ПО «Minor Variant Finder» для генетических анализаторов фирмы Applied Biosystems предлагается как удобное в использовании ПО для поиска малопред-ставленных вариантов соматических мутаций а также подходящее для оценки уровня аллельной нагрузки соматическими мутациями. Наиболее часто встречающейся драйверной мутацией среди пациентов с хроническими миелопролиферативными неоплазиями (ХМН) является мутация c.1849 G>T (V617F) в 14 экзоне гена JAK2.

Целью Определение уровня аллельной нагрузки соматической мутацией c.1849G>T (V617F) в гене JAK2 с помощью программы «Minor Variant Finder» в образцах ДНК от пациентов с диагнозом ХМН.

Материалы и методы. Исследовали образцы ДНК 5 пациентов с диагнозом ХМН и разным уровнем аллельной нагрузки ранее выявленной мутации c.1849 G>T (V617F) в гене JAK2. ДНК выделяли из лейкоцитов венозной крови с использованием набора реагентов GeneJETTM (ThermoFisherScientific). Участок гена JAK2 (377bp) амплифицировали, используя праймеры JAK2_F (5›-CAAAGCACATTGTATCCTCA-3›) и JAK2_R (5›-AGTCCTACAGTGTTTTCAGT-3›). Продукт ПЦР очищали ExoSAP-IT. Секвенирующую ПЦР с прямого и обратного праймеров, а также очистку полученного продукта проводили с использованием наборов BigDyeTerminatorv3.1 и BigDyeXTerminator. Пробы подвергали капиллярному электрофорезу на генетическом анализаторе 3500. Полученные сиквенсы срав- нивали с референсной последовательностью гена JAK2 (NM_004972.3) и контролями для обоих праймеров в программе «Minor Variant Finder» (Applied Biosystems, США) для определения уровня аллельной нагрузки мутацией c.1849 G>T (V617F) в 14 экзоне гена JAK2. В качестве контроля использовали ДНК пациента без вышеуказанной мутации.

Результаты. Важно отметить, что ПО «Minor Variant Finder» имеет существенное ограничение и может быть использовано для поиска малопредставленных вариантов соматических мутаций и определения уровня аллельной нагрузки только при анализе однонуклеотидных замен и не может быть использовано в случае indel мутаций. При анализе мутации c.1849G>T (V617F) в 14 экзоне гена JAK2 указанное ПО удобно использовать как для поиска малопред-ставленных вариантов,так и для определения уровня аллельной нагрузки данной мутацией. Уровень аллельной нагрузки мутацией c.1849 G>T при использовании ПО «Minor Variant Finder» у пациента № 1 составил 5,1 % и 4,7 %; № 2–11,0 % и 19,1 %; № 3–14,1 % и 17,7 %; № 4–12,0 % и 12,8 %; № 5–41,2 % и 37,8 % с прямого и обратного праймеров,соответственно. Ранее данный показатель для выбранных пяти образцов ДНК был определен либо методом пиросеквенирования,либо ПЦР-РВ и составил 5,2, 10,5, 15,7, 14,3 и 35,2 %, соответственно.

Выводы. ПО «Minor Variant Finder» может быть использовано для выявления малопред-ставленных вариантов и оценки уровня аллельной нагрузки соматической мутации c.1849 G>T (V617F) в 14 экзоне гена JAK2. Важно отметить что использование ПО «Minor Variant Finder» позволяет увеличить выявляемость соматических мутаций, поскольку в случае присутствия в образце ДНК менее 20 % мутантного аллеля и анализе результатов секвенирования по Сенгеру без применения данного ПО нельзя быть уверенным в наличии мутации.