Анализ возможной роли генетических факторов в определении уровня основных показателей липидного профиля сыворотки крови у жителей Республики Башкортостан

Изучение показателей липидного обмена, выявление распространенности и закономерностей развития его нарушений имеет большое теоретическое и практическое значение. Липидный обмен – один из сложнейших обменов в организме человека. Значение липидов в организме велико: они образуют липидную матрицу клеточных мембран и органелл клеток, составляют основу центральной нервной системы, принимают участие в пластическом и энергетическом обменах, в адаптационных и иммунологических реакциях, процессах пищеварения и свертывания крови, обеспечивают теплоизоляцию, необходимы при синтезе ферментативных систем и гормонов.

К нарушениям липидного спектра относятся повышение уровня общего холестерина (ОХС), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), триглицеридов (ТГ) и снижение липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в результате нарушения синтеза, транспорта и расщепления липопротеинов – липидн о-белковых ком плексов, являющихся транспортной формой липидов крови и во многом определяющих их метаболизм. Показатели липидного спектра сыворотки крови – наиболее часто используемые в клинической практике параметры липидного обмена.

Генотип человека не меняется в течение жизни и не подвержен влиянию модифицирующих факторов внешней среды, то есть анализ ДНК позволяет выявить генетическую предрасположенность к нарушению липидного обмена задолго до проявления клинических признаков заболеваний связанных с ним.

Следовательно, для оценки инициации и прогрессирования нарушений метаболических процессов наряду с биохимическими показателями липидного профиля сыворотки крови целесообраз-

но использовать и молекулярно-генетические маркеры.

В литературе имеются данные различных исследований зависимости уровня ОХС, ТГ, ЛПВП и ЛПНП от аллельных вариантов целого ряда генов, которые явно или предположительно участвуют в регуляции липидного обмена. К числу наиболее важных относятся гены семейства ядерных рецепторов, активируемых пролифера-торами пероксисом типа α, δ; ( PPARA, PPARD ) , ген липопротеинлипазы ( LPL ) и ген белка-переносчика эфиров холестерина ( CETP ) .

В связи с этим, нами проведен анализ ряда аллельных вариантов в генах PPARA (G2528C) , PPARD ( T+294C ), LPL ( T+495C ) и CETP ( A277G ) в двух группах – с высокими/низкими и в пределах нормы уровнями основных показателей липидного профиля сыворотки крови.

Гены, кодирующие белки PPARα и PPARδ человека (обозначаемые как PPARA и PPARD , соответственно) локализованы на разных хромосомах, но в целом имеют сходную структуру. Они состоят из 6-8 кодирующих экзонов и регулируют экспрессию большинства генов, вовлеченных в обмен жиров и углеводов [5].

Ген ядерного рецептора активируемого пролифератором пероксисом типа α (PPARA) локализован на 22 хромосоме (22q13.31) и экспрессируется в медленных мышечных волокнах (МВ), печени, сердце и бурой жировой ткани, причем в мышцах ген PPARA экспрессируется в 7 раз больше, чем в жировой ткани [19]. Основная функция белка PPARα – регуляция обмена липидов, глюкозы и энергетического гомеостаза, а также массы тела посредством контроля экспрессии генов, вовлеченных в перокси-сомальное и митохондриальное окисление, транспорт ЖК, синтез липопротеинов, катаболизм триглицеридов [15]. В данной работе рассматривается G/C полиморфный вариант 7-го интрона (rs4253778) гена PPARA, обусловленный трансверсией нуклеотида G на C в 2528 позиции 7 интрона этого гена.

Ген ядерного рецептора активируемого пролифератором пероксисом типа δ ( PPARD ) локализован на 6 хромосоме (6p21.1-p21.2), одинаково экспрессируется как в жировой ткани, так и в скелетных мышцах [10] . На трансгенных моделях было показано, что у нокаутных по PPARD мышей от рождения снижена масса тела, нарушены процессы заживления кожи, дефектна миелиновая оболочка нервных клеток, а при высокожировой диете они значительнее набирают жировую массу по сравнению с контрольной группой [22]. Нами изучен полиморфный вариант T+294C (rs2016520) гена PPARD , обусловленный транзицией нуклеотида Т на С в +294 позиции нетранслируемой области 4 экзона этого гена.

Среди генов-мишеней PPAR можно выделить активируемый им ген липопротеинлипазы LPL [20] , локализованный на 8 хромосоме (8p22), длиной 35 т.н.п., содержащий 10 экзонов. Ген LPL экспрессируется главным образом в скелетной мускулатуре, жировой ткани и сердечной мышце [11] . Липопротеинлипаза (lipoproteinlipase) – гидролаза (сериновый фермент), осуществляющая гидролиз триглицеридов, находящихся в составе хиломикронов (ХМ) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП), до моноглицеридов и свободных жирных кислот. Нами был изучен полиморфный вариант Hind III гена LPL обусловленный трансверсией нуклеотида Т на G в +495 позиции 8 интрона этого гена, приводящей к образованию сайта рестрикции для фермента Hind III.

Ген СЕТР локализован на 16 хромосоме (16q21), длиной 25 т.н.п., содержит 16 экзонов и экспрессируется в печени, жировой ткани, в меньшем количестве в тонком кишечнике, надпочечной железе, сердце, почках и скелетной мускулатуре [17]. CETP (cholesterol ester transfer protein) – специфический белок с массовой долей 74 кДа, переносящий липиды сыворотки крови, катализирующий реакцию обмена эфиров холестерина (ЭХС) и триглицеридов (ТГ) между липопротеинами. В результате такого обмена определенная масса ТГ переносится из липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП) к липопротеинам низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинам высокой плотности (ЛПВП), а эквивалентная масса ЭХС перемещается из ЛПНП и ЛПВП к ЛОНП. Таким образом, СЕТР ответственен за поддержание нормального уровня холестерина, так же как ЛПНП и ЛПВП. Как известно, существует обратная корреляция между уровнем ЛПВП и развитием атеросклероза. ЛПВП осуществляют транспорт холестерина из сосудистой стенки в печень. Нами рассмотрен полиморфный вариант A277G (TaqIB) гена белка-переносчика эфиров холестерина СЕТР, обусловленный транзицией нуклеотида А на G в 277 позиции 1 интрона этого гена.

Таким образом, изучение механизмов генетической регуляции липидного обмена на сегодняшний день приобретает особую актуальность. В частности, представляется важным выявление связи между носительством определенных генотипов изучаемых аллельных вариантов генов с показателями липидного спектра, что позволит выделить лица с высоким риском развития нарушений метаболизма липидов на ранних этапах и, возможно, осуществить целенаправленное лечение и профилактику осложнений.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследовано 453 здоровых индивида (223 мужчин и 230 женщин) в возрасте от 18 до 65 лет, проживающих на территории РБ. Всеми обследуемыми даны письменные согласия на проведение биохимических и молекулярногенетических исследований в рамках данной работы.

Материалом для проведения биохимических анализов послужила сыворотка крови, взятая без следов гемолиза. Перед взятием крови испытуемые соблюдали строгую диету (минимум 12 ч) и находились в сидячем положении в течение 30 минут. Кровь взята из вены. После осуществления забора крови сыворотка была отделена от эритроцитов и использована для проведения биохимических анализов.

Концентрации основных показателей липидного профиля: ОХС, ТГ, ЛПВП в сыворотке крови определены ферментным методом реактивами фирмы “Cormay” (Германия) на анализаторе «Флюорат-02-АБЛФ-Т» (Россия). Расчет концентрации ЛПОНП проводился по формуле: ЛПОНП = ТГ/2,18 [1]. ЛПНП проводили по формуле, предложенной Фридвальдом [8]: ЛПНП = ОХС - (ЛПВП + ЛПОНП) .

К повышенному уровню общего холестерина относили значения ОХС>5.2 ммоль/л (200 мг/дл), повышенным уровнем ЛПНП считали > 3.35 ммоль/л (130 мг/дл). К повышенным концентрациям триглицеридов относили уровень ТГ>1.7 ммоль/л (150 мг/дл) Сниженным уровнем ЛПВП считали значения ЛПВП<1.8 ммоль/л (60 мг/дл) (ВНОК, 2003).

Материалом для проведения молекулярногенетического исследования служили образцы ДНК, полученные методом фенольнохлороформной экстракции (Mathew; 1984).

Анализ полиморфных ДНК-локусов : PPARA (G2528C) , PPARD (T+294C) , LPL (T+495C) и CETP (A277G) осуществляли методом ПЦР-ПДРФ с использованием соответствующих праймеров и специфических эндонуклеаз рестрикции [7, 11, 13, 21].

Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в 7 % полиакриламидном и 1,5 % агарозном гелях, окрашенных бромистым этидием с последующей визуализацией ДНК в УФ-свете.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения MS Excel XP (“Microsoft»). Соответствие эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга оценивали по критерию χ ², по алгоритму [18] . Статистически значимыми считали значения при Р<0,05.

Вся исследуемая выборка была разделена на 2 группы в зависимости от основных показателей липидного профиля (ОХС, ТГ, ЛПНП, ЛПВП): 1 группа – контрольная (лица, имеющие показатели липидного профиля в норме); 2 группа – группа сравнения (лица, имеющие показатели липидного профиля отличные от нормы).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Понимание фундаментальных основ белок-белковых взаимодействий на пути метаболизма липидов (липопротеинов) является решающим для прогнозирования возможных нарушений липидного обмена в организме человека.

Нами определены частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов PPARA, PPARD, LPL, СЕТР в двух группах, различающихся по содержанию основных показателей липидного спектра.

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов как в выборке лиц, имеющих концентрации ОХС, ТГ, ЛПНП и ЛПВП в норме, так и в группе лиц, имеющих концентрации данных показателей выше/ниже нормы не выявлено достоверно значимых различий между мужчинами и женщинами. Поэтому при анализе ассоциаций половую принадлежность во внимание не принимали.

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного варианта G2528C гена PPARA между исследованными группами выявлено статистически значимое различие. В группе лиц, имеющих высокий уровень триглицеридов (ТГ) обнаружено достоверное повышение аллеля PPARA *G (Р=0.0445; χ ²=4.0039) и генотипа PPARA *G/*G (Р=0.0524; χ ²=3.7638). Также выявлена тенденция к повышению аллеля PPARA*G (Р=0.0651; χ ²=3.4024) в группе лиц, имеющих высокий уровень липопротеинов низкой плотности.

Полученные нами результаты о негативном влиянии аллеля PPARA *G и генотипа PPARA *G/*G на уровень ТГ и ЛПНП, можно объяснить следующим фактом: сверхэкспрессия гена PPARA приводит к снижению утилизации глюкозы и к повышению окисления ЖК в скелетных мышцах [6]. Как известно, в миокарде как снижение, так и повышение экспрессии гена PPARA у мышей вызывает гипертрофию миокарда и кардиомиопатию [3, 6].

При анализе ассоциаций полиморфного варианта T+294C гена PPARD выявлено достоверное повышение аллеля PPARD *С (Р=0.0010; χ ²=13.0741) и понижение генотипа PPARD *T/*Т (Р=0.0520; χ ²=3.7774) в группе лиц, имеющих показатели общего холестерина выше нормы.

Ряд работ свидетельствует о негативном эффекте аллеля PPARD *C на липидный обмен. Так, в группе здоровых мужчин носители генотипа PPARD *C/*С имели значимо более высокие показатели липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и аполипопротеина B по сравнению с носителями генотипа PPARD *T/*T [23] . В группе пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца, носители аллеля PPARD*C имели значимо меньшую концентрацию протективных в отношении атеросклероза липопротеинов высокой плотности [23].

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта T+495G гена LPL выявил статистически значимые различия между исследуемыми группами вследствие повышения частоты гомозиготного генотипа LPL *H+/*H+ (39.19% против 25.61% в группе лиц с показателями ОХС в норме; χ ²=4.6766; Р=0.0309; OR=0.5348; 95%CI 0.30240.9475) в группе лиц с высокими показателями ОХС. Также выявлена тенденция к повышению аллеля LPL *H+ (67.87% против 57.17% соответственно; χ ²=3.1964; Р=0.0738; OR=1.5765; 95%CI 0.9608-2.5962) и генотипа LPL *H+/*H+ (40% против 25.26% соответственно; χ ²=3.5692; Р=0.0589; OR=0.5073; 95%CI 0.2525-1.0235) в группе лиц, имеющих показатели высокие показатели триглицеридов.

Литературные источники свидетельствуют о наличии ассоциации генотипа LPL *Н+/*Н+ с повышением уровня ОХС, ТГ и понижением уровня ЛПВП сыворотки крови [4]. Многими исследователями обнаружены ассоциации Т+495С (HindIII) полиморфного варианта гена LPL с сердечно-сосудистыми заболеваниями [2, 12]. В частности, отмечена более высокая частота аллеля LPL *Н+ у пациентов с коронарным атеросклерозом по сравнению с контрольной группой [2, 9, 12]. Согласно этим данным, аллель LPL *Н+ обуславливает снижение экспрессии гена LPL и как следствие, характеризуется пониженной активностью самого фермента. Сделан вывод, что аллель LPL *Н+ является фактором риска развития нарушений метаболизма липидов и ассоциирован с нарушениями метаболизма липидов. В связи с этим обращает на себя внимание и высокая частота генотипа LPL *Н+/*Н+ и аллеля LPL *Н+ у лиц, имеющих повышенный уровень ОХС, ТГ, выявленная в ходе данной работы.

Возможно, генотип LPL *Н + /*Н+, ассоциированный с более высоким уровнем холестерина, триглицеридов и липопротеинов низкой плотности, способствует более раннему развитию сердечно-сосудистых заболеваний. Эти данные позволяют рассматривать генотип LPL *Н + /*Н+ в качестве фактора риска развития ССЗ. Генотип LPL *Н + /*Н+ также является одним из маркеров предрасположенности к инфаркту миокарда [2, 12]. Это подтверждается и исследованиями Gerdes et. al [9], которые показали, что высокая частота генотипа LPL *Н + /*Н+ была отмечена среди мужчин в возрасте 40 лет с наследственной отягощенностью по инфаркту миокарда.

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного варианта A277G гена CETP в группе лиц, имеющих повышенный уровень ЛПНП выявлено повышение аллеля CETP*B1 (Р=0.0423; χ ²=4.1266), а также обнаружена тенденция к понижению генотипа CETP*B2/*B2 (Р=0.0632; χ ²=3.4512).

Наши результаты по изучению полиморфного варианта A277G (Taq IB ) гена СЕТР не противоречат данными Kuivenhoven et.al. [14], которые показали более раннее развитие коронарного атеросклероза у носителей генотипа СЕТР *В1/*В1. Если учесть, что аллель СЕТР *В1 ассоциирован с более низким уровнем ЛПВП и высоким содержанием белка по сравнению с аллелем СЕТР *В2, то это объясняет более высокую вероятность раннего развития атеросклероза у людей с генотипом СЕТР *В1/*В1 . Наследственная отягощенность по сердечнососудистым заболеваниям также в большей степени отмечена среди носителей аллеля СЕТР *В1 и генотипа СЕТР *В1/*В2 [14].

В литературе имеются данные об ассоциации аллеля СЕТР*В2 с пониженным уровнем этого белка, увеличением способности удалять холестерин из клеток и сосудистого русла, а также с повышенным уровнем ЛПВП, соответственно с пониженным риском развития сердечнососудистых заболеваний [14].

В целом наши и литературные данные свидетельствуют о несомненном участии полиморфных вариантов генов в составе генетической детерминанты уровней основных показателей липидного профиля сыворотки крови человека.

Таким образом, полученные в данном исследовании результаты свидетельствуют о том, что генетические варианты генов PPARA (G2528C), PPARD (T+294C), LPL (T+495C) и CETP (A277G), вносят вклад в детерминацию нарушений метаболизма липидов. В частности у жителей РБ генетическими маркерами нарушений липидного обмена могут являться следующие аллели: PPARA *G, PPARD *С, LPL *H+, СЕТР *В1 и следующие генотипы: PPARA *G/*G, LPL H+/H+, СЕТР В1/В1.

Работа выполнена в «Центре молекулярногенетических исследований» при кафедре генетики БГПУ им. М. Акмуллы.