Андрогенез сортов ярового рапса (Brassica napus L.) и оценка регенерантов на фертильность пыльцы

Введение. В современной селекции особое внимание уделяется созданию генетического разнообразия сельскохозяйственных культур. Для этого используют отдаленную гибридизацию, мутагенез и трансформацию растений. В дополнение к этим методам в последние годы широко изучается изменчивость растений и клеток в условиях in vitro .

На сегодняшний день гаплоидные технологии являются неотъемлемой частью селекционных программ по созданию высокопродуктивных гибридов и сортов многих сельскохозяйственных культур, так как позволяют существенно сократить сроки получения исходного гомозиготного материала [1]. Гаплоиды ярового рапса получают с использованием культуры пыльников и микроспор на искусственных питательных средах.

Удвоенные гаплоиды, полученные на основе гибридов F1, обеспечивают возможность ускоренного получения гомозигот и сокращения объемов селекционной работы. Получение растений из микроспор в культуре пыльников является распространенным методом создания гомозиготных линий у многих видов Brassica [2, 3].

На получение андроклинных линий оказывают влияние условия выращивания донорных растений, предварительная обработка бутонов пониженной положительной температурой, состав питательной среды и условия культивирования пыльников [4–7]. Правильный подбор условий культивирования позволяет максимально реализовать андрогенетический потенциал растения. Но лимитирующим фактором остается влияние генотипа донорного растения, которое проявляется в частоте эмбриоидогенеза, качестве эмбриоидов и их регенерационной способности.

Цель исследований: изучить способность генотипов ярового рапса отечественной и зарубежной селекции к индукции эмбриоидов в культуре пыльников in vitro , а также регенерационный потенциал сформировавшихся эмбриоидов и фертильность полученных из них андроклинных растений.

Задачи: ввести в культуру in vitro изолированные пыльники, определить частоту индукции эмбриоидогенеза изучаемых генотипов и их регенерационную способность.

Материалы и методы. В качестве донорного материала использовались сорта ярового рапса отечественной (Авангард, Аккорд, Булат, Визит, Лира, Липецкий, Ратник, Рубеж) и зарубежной (Topas и гибрид Salsa) селекции. Предварительная оценка андрогенетического потенциала образцов с ценными признаками необходима для массового получения дигаплоидов, которые могут быть включены в селекционные программы. Также это является обязательным этапом при выполнении некоторых биотехнологических программ, например таких, как физический и химический мутагенез in vitro [8].

Сбор соцветий, определение стадии развития микроспор в пыльниках проводили согласно общепринятой методике, использующейся в лаборатории биотехнологии ЛНИИР [9]. Срезанные соцветия помещали в стакан с водным раствором гиббериллиновой кислоты в концентрации 0,1 мг/л на 48 ч в холодильник при температуре 4 °С. Далее соцветия стерилизовали в 7 % водном растворе «Domestos» в течение 10 мин последующим 3-кратным промыванием стерильной дистиллированной водой. Изолирование пыльников проводили в асептических условиях. Пыльники культивировали в темноте на питательной среде В5 с добавлением 2,4-Д и НУК в концентрациях 0,1 мг/л. На первом этапе инкубировали в течение 48 ч при температуре 35 °С в условиях термостата, на втором этапе – при 26 °С до формирования эмбриоидов. Сформировавшиеся эмбриоиды выдерживали при непрерывном освещении до появления хлорофилла. Зеленые эмбриоиды пересаживали на регенерационную питательную среду с концентрацией сахарозы, уменьшенной до 1 %, и без добавления регуляторов роста. Образовавшиеся проростки с хорошо развитой корневой системой и 3 настоящими листочками пересаживали в смесь почвы и песка в соотношении 3 : 1 и накрывали пластиковыми стаканами для акклиматизации в условиях теплицы.

В фазу цветения фертильные растения закрывали изоляторами, а стерильные (гаплоидные) подвергали воздействию колхицина с целью удвоения числа хромосом. Оценку жизнеспособности пыльцы проводили с помощью флуоресцеиндиацетата (FDA) [10].

Результаты и их обсуждение. Отзывчивые пыльники всех изучаемых сортов при культивировании на инициальной питательной среде формировали эмбриоиды следующих типов: семядольные (котиледольные), торпедовидные, сердцевидные, глобулярные и полиэмбриоиды. По способности к эмбриоидогенезу донорные сорта отличались между собой (табл.). Минимальная частота эмбриоидогенеза наблюдалась у сорта Ратник – 0,07 %, а максимальная индукция эмбриоидов составила 9,26 % – у сорта Topas. Различия с другими изучаемыми сортами достоверны.

Изучаемые генотипы отличались также и по способности к регенерации растений из первичных эмбриоидов (табл.). У сортов Авангард и Рубеж растения получить не удалось. Максимальное количество растений формировали эмбриоиды сортов Аккорд (20 растений) и Ермак (22 растения). В то же время эмбриоиды сортов Лира и Ратник имели 100 % регенерацию растений. Значительная часть (56,6 %) первичных эмбриоидов хорошо прорастала в нормальные растения на регенерационной питательной среде без содержания регуляторов роста.

У сорта Topas только сердцевидные и торпедовидные эмбриоиды прорастали на среде без содержания гормонов. Котиледольные эмбриоиды имели сросшиеся семядольные листочки, которые способствовали сдерживанию развития настоящих листьев. Стебель у таких эмбриоидов утолщался и на поверхности проростков формировались вторичные эмбриоиды. Регенерационная способность растений сорта Topas составила 23,5 %.

Андрогенез пыльников in vitro сортов ярового рапса

Сорт	Количество, шт.		Частота эмбриоидогенеза, %	Получено растений, шт. (%)
	культивируемых пыльников	эмбриоидов
1	2	3	4	5
Авангард	1248	1	0,08	0
Аккорд	1933	21	1,09	20 (95,3)
Булат	1585	3	0,19	2 (66,7)
Визит	3785	31	0,82	5 (16,1)
Ермак	2448	26	1,06	22 (84,6)

Окончание табл.

1	2	3	4	5
Лира	2315	11	0,48	11 (100)
Липецкий	2171	10	0,46	9 (90,0)
Ратник	1514	1	0,07	1 (100)
Рубеж	832	1	0,12	0
Topas	367	34	9,26	8 (23,5)
Salsa	214	4	1,87	2 (50,0)
Всего	18422	143	0,77	81 (56,6)
НСР 0,05	–	–	0,52	–

Наблюдения за развитием андроклинных растений, полученных из первичных эмбриоидов, показали, что многие из них имели в цветках редуцированные пыльники. Основная масса таких растений представляла собой гаплоиды. На рисунке 1, а, показано растение с рыхлым цветком, лепестки широко раскрыты, маленькие редуцированные пыльники хорошо видны (классический вид гаплоидного цветка рапса). Помимо класси- ческих гаплоидных были выявлены растения с морфологическими изменениями в строении цветка. На рисунке 1, б, представлено соцветие андроклинного растения гибрида Salsa, у которого отсутствовали пыльники и тычиночные нити. Можно предположить, что данные растения являются стерильным компонентом, использованным при создании гибрида.

а                                          б

Рис. 1. Соцветия цветущих андроклинных растений ярового рапса: а – соцветие гаплоидного растения сорта Аккорд; б – соцветие стерильного растения гибрида Salsa

Также были обнаружены растения с отклонениями в развитии пыльников (недоразвитые и утолщенные части пыльника). Цитологический анализ показал, что такие недоразвитые пыльники продуцируют очень малое количество пыль- цы, большая часть которой является стерильной (рис. 2). Cтерильная пыльца на препарате не окрашивалась, а фертильная приобретала окраску от сиреневого до светло-бордового цвета.

Рис. 2. Пыльца в недоразвитых пыльниках (× 250)

Все полученные андроклинные растения во время цветения были закрыты изоляторами. Часть изолированных соцветий характеризовалась нормальным развитием цветков и пыльников, но при этом показала очень низкую завязы- ваемость семян (1–3 шт.) (рис. 3, а). Анализ пыльцы этих растений выявил наличие большого числа стерильных пыльцевых зерен (рис. 3, б), что и стало причиной низкой завязываемости семян при проведении самоопыления.

а

Рис. 3. Пыльники и пыльцевые зерна андроклинного растения сорта Ратник: а – цветок с нормальными пыльниками; б – смесь стерильной и фертильной пыльцы (× 250)

Можно предположить, что в процессе культивирования на искусственной питательной среде у некоторых эмбриоидов произошли генетические изменения, что привело к нарушениям развития во время микроспорогенеза.

В дальнейших исследованиях планируется выявлять андроклинные растения с наличием стерильной пыльцы для использования их в гибридизации.

Заключение. Проведенное исследование позволило выделить генотипы, отзывчивые к эмбриоидогенезу в культуре пыльников in vitro . Наибольшее количество эмбриоидов (9,26 %) было получено у сорта Topas. Также были выделены 4 донорных образца, обладающие высокой регенерационной способностью первичных эмбриоидов. Это сорта Аккорд (95,3 %), Ермак (84,6), Лира (100) и Ратник (100 %). Максимальное количество андроклинных растений получили у сортов Аккорд (20 шт.) и Ермак (22 шт.). Перечисленные выше сорта являются перспективными донорами для получения дигаплоидов в культуре пыльников in vitro и дальнейшего их использования в селекционных программах.

Часть андроклинных растений имела нарушения в развитии пыльников, продуцировавших очень малое количество пыльцы, большая часть которой была стерильной. Также были получены регенеранты с нормальным развитием пыльников, содержащие разнокачественную пыльцу (стерильную и фертильную). Анд- роклинные растения с наличием стерильной пыльцы перспективны для использования их в гибридизации.