Анналы криобиологии. Классификации криопротекторов и криоконсервантов для клеток крови и костного мозга.

Введение. В ФГБУН «Кировский научноисследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медикобиологического агентства» с 1976 г. активно разрабатываются методы экспериментальной и клинической трансфузионной криобиологии. Под руководством Е. П. Сведенцова учениками его научной школы были разработаны новые криопротекторы и криоконсерванты на их основе дляживых клеток,достиг-нуты серьезные успехи в длительном сохранении в замороженном виде в биологически полноценном состоянии клеточных суспензий компонентов крови и костного мозга.Из- учены результаты применения трансфузий размороженных эритроцитов, лейкоцитов тромбоцитных концентратов,а также трансплантаций аутологичных и аллогенных гемопоэтических стволовых клеток при лечении гемобластозов, сепсиса, некоторых солидных опухолей и других патологий. Подтверждены выводы отечественных и зарубежных исследователей, о том, что, наряду с положительными защитными свойствами, используемые в клинике криоконсерванты проявляют побочное токсическое действие на клеточном и организменном уровне [1–3].Поэтому одним из нерешенных вопросов в трансфузи- онной криобиологии является создание,из-учение и использование новых нетоксичных или малотоксичных клеточных антифризов. Важная роль в научном поиске оптимального метода криоконсервации компонентов крови и костного мозга отводится систематизации накопленных в мировой криобиологии теоретических сведений о криопротекторах и криоконсервантах.

Целью настоящей работы явилось ознакомление специалистов биологических и медицинских учреждений с историческими вехами развития науки о криопротекторах и криоконсервантах на их основе для длительного сохранения компонентов крови и костного мозга, применяемых с лечебной целью.

Материалы и методы. Проанализирована отечественная и зарубежная литература по различным аспектам криоконсервирования клеток крови и костного мозга.

Проблема сохранения в замороженном состоянии эритроцитной массы (ЭМ), эри-троцитной взвеси (ЭВ), лейкоконцентрата (КЛ), тромбоконцентрата (КТ), гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и ядерных клеток костного мозга (ЯККМ) является одной из актуальных задач современной трансфузионной криобиологии. Основоположником криобиологии и учения о криопротекторах — защитных веществах, способных предотвращать развитие терминальных криоповреждений в живых биосистемах на этапах их низкотемпературного консервирования является Н. А. Максимов. Ученому принадлежит приоритет в выявлении криозащитного свойства в отношении живых клеток у многоатомного спирта глицерина [4]. Первая трансфузия размороженных клеток крови с лечебной целью была осуществлена Моллисоном и Словитером в 1951 г. [5].

В многостороннем глубоком изучении вопросов адаптации клеточных суспензий растительного и животного мира к гипо-и анабиозу преуспели ученые Харьковского Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, в котором активно сотрудничают теоретики-экспериментаторы, химики, криофизиологи, криобиологи криоинженеры, токсикологи, фармакологи трансфузиологи и другие специалисты.В работах ученых ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России, выполненных на высоком международном уровне совместно с Харьковскими кри- обиологами, показано, что криопротекторы и криоконсерванты на их основе уменьшают интенсивность адаптационного процесса снижают уровень клеточного метаболизма, делают клетки менее восприимчивыми к криоповреждениям [6]. Основная масса повреждений клеточных структур на этапах холодовой адаптации-замораживания-ото-гревания КДК и ЯККМ связана с обезвожива-нием,образованием вне- и внутриклеточных кристаллов льда, а также токсичностью криопротекторов.

К настоящему времени в качестве перспективных криопротекторов апробировано больше 120 веществ, принадлежащих к разным классам химических соединений. Это спирты (метанол, этанол, этиленгликоль пропиленгликоль, диэтиленгликоль, глицерин, манит, сорбит и др.), альдегиды, амины, аминокислоты и их амиды (диметилацетамид, мочевина и др.), оксиды (диметилсульфоксид и др.), углеводы (глюкоза, лактоза сахароза и др.), искусственные полимеры (поливинилпирролидон, оксиэтилирован-ный крахмал, полиэтиленоксид и др.), неорганические соли (натрий хлористый, калий хлористый, кальций хлористый, натрий фосфорнокислый одно-, двух- и трехзамещенный, динатриевая соль ЭДТА и др. [3, 4].

В изучении известных и синтезе новых криопротекторов и криоконсервантов на их основе очень важен выбор рабочей классификации разрабатываемых химических соединений. В историческом плане следует отметить работу J. Lovelock [7], который одним из первых предложил различать криопротекторы по способности проникать через плазматическую мембрану клетки. Автор выделил эндоцеллюлярные криопротекторы проникающие в клетки (КПК), и экзоцеллю-лярные криопротекторы, не проникающие в клетки (КНК).

Н. С. Пушкарь и соавт. [8] добавили к двум названным третью группу — криопротекторы смешанного действия (КСД), проявляющие одновременно эффекты КПК и КНК.

• Н. Maryman [9] уточнил, что эффектом КПК из низкомолекулярных обладают глицерин диметилсульфоксид (ДМСО), диметилацетамид (ДМАЦ), α-пропиленгликоль (1,2-ПД) этиленгликоль (ЭГ) и др., у которых молекулярная масса (м. м.) до 101. Активными КНК являются вещества с м. м. выше 101: поливи-нилпирролидон (ПВП), гидроксиэтилкрахмал

(ГЭК), полиэтиленгликоль (ПЭГ) и углеводы.

Эффективные КСД имеют м. м. 400 и выше. Это полиэтиленоксид (ПЭО с м. м. 400), гекса-метиленгидроксиэтилмочевина (ГМБТОЭМ с м. м. 378), оксиэтилированный глицерин с м. м. до 1400. ПЭО-400 имеет в составе мономерные фракции как эндо-,так и экзоцеллю-лярного действия. Причем, основная масса полимера не проникает через плазматическую мембрану внутрь клетки [4, 8]. В работах подчеркнута зависимость сохранности клеток от скорости проникновения криопротектора внутрь биообъекта, молекулярной массы (чаще понижается с увеличением м. м.) и видовой принадлежности клеток [10].

Для систематизации имеющихся многокомпонентных хладоограждающих растворов, а также создающихся новых криофи-лактиков с реставрирующими добавками Е. П. Сведенцов предложил оригинальную классификацию гемоконсервантов, разделенную на четыре класса [3], в которых учитываются устоявшиеся названия криопротекторов и их свойства,описанные и обоснованные J. Lovelock [7], Н. С. Пушкарем и соавт. [8], H. Meryman [9] и другими исследователями. Обращают внимание отличия от известных классификаций криоконсервантов по характеру состава, количеству и, особенно по классу комбинированных криоконсервантов, выделеных в IV класс:

I класс криоконсервантов включает эндо-целлюлярные криоконсерванты; по числу криопротекторов в составе криоконсерван-та:монокриоконсерванты — содержат по одному эндоцеллюлярному криопротектору и бикриоконсерванты — содержат по два эн-доцеллюлярных криопротектора;

II класс криоконсервантов образуют экзо-целлюлярные криоконсерванты; монокриоконсерванты — содержат по одному экзоцел-люлярному криопротектору; бикриоконсерванты — содержат по два экзоцеллюлярных криопротектора;

III класс криоконсервантов образован криоконсервантами смешанного действия монокриоконсерванты — содержат по одному криопротектору смешанного действия бикриоконсерванты — содержат по два криопротектора смешанного действия;

IV класс криоконсервантов включает комбинированные криоконсерванты, в т. ч.: би-комбинированные криоконсерванты эндо-и экзоцеллюлярного действия — содержат два криопротектора I и II классов; бикомби-нированные криоконсерванты эндоцеллю-лярного и смешанного действия — содержат два криопротектора I и III классов.

Во всех классах криоконсервантов могут быть использованы одна-две и больше «улучшающих» добавок.

Обращает на себя внимание то, что криопротекторы разной химической природы не имеют определенных границ по молекулярной массе и уровню токсичности (табл. 1) [3, 4]. Как показали исследования, высокая хладоограждающая активность обнаруживается как у низкомолекулярных (этиленгликоля с м. м. 62; ДМСО с м. м. 78, 13; глицерина с м. м. 92,1), так и у высокомолекулярных химических веществ (ГЭК с м. м. 250 000– 500 000, ПЭГ с м. м. 1500).

Токсичность криопротекторов характеризуется показателями их общей токсичности — токсичности на организменном уровне и цитотоксичности — токсичности на клеточном уровне. Токсичность веществ оценивается среднелетальной дозой (ЛД50, г/кг), при введении которой погибает 50 % подопытных животных [3, 4]. Значительной токсичностью обладают «сильные» эндоцеллюлярные криопротекторы (КПК). В несколько раз меньше токсичность у КСД.Очень слабую токсичность проявляют КНК. Практикапоказывает, что методические приемы определения общей и цитотоксичности требуют совершенствования. В криобиологии принято сравнивать токсичность криопротекторов по выявленной ЛД50 у белых лабораторных мышей.В то же время токсичность КПК уменьшается с увеличением их молекулярной массы [3, 4]. Далее, теряя свойства КПК, химические соединения переходят в класс КНК, Так, например, происходит с производными глицерина монометилгли-церином и диметилглицерином. А. А. Цуцаева и соавт. [4], а также другие исследователи [3 6, 10] считают, что все криопротекторы, за исключением ПЭО-400–500 и ГМБТОЭМ-380, в зависимости от условий экспозиции в клеточной суспензии способны оказывать токсическое действие на организм и требуют удаления из клеточной суспензии перед введением ее в организм субъекта. Данная технология затратна, а также снижает морфологическую и биологическую полноценность трансфузионной среды.

Новым направлением в совершенствовании методов криоконсервирования КДК и ЯККМ стали исследования по созданию многокомпонентных сред, в рецепты которых, наряду с криопротекторами, вводятся «реставрирующие» добавки: углеводы, белки плазмы, биологически активные соединения соли и другие вещества с целью поддержания энергетического обмена в размороженных клетках, уменьшения токсичности, других побочных воздействий, а также содействия репаративным процессам в клеточной суспензии после замораживания-отогревания [3, 4].

Таблица 1.

Криопротектор	М. м.	ЛД50, г/кг	Авторы	Компонент крови или ЯККМ
Этиленгликоль (КПК)	62	Низкая на клеточном и выраженная на организменном уровне	Р.Bautron at al. [1979]	КЭ
Пропиленгликоль или 1,2-ПД (КПК)	76,1	13,1	В. М. Гучок [1981]	КЭ
Глицерин (КПК)	92,1	4,57±0,14	K. C. Anderson at al. [1950]	КЭ, ГСК
ДМСО (КПК)	78,13	3,8±0,1	M. J. Ashwood-Smith [1961]	КТ, КЛ ГСК
ДМАЦ (КПК)	87	4,2 (2,5–3,9)	А. А. Цуцаева и соавт. [1983]	КТ, КЛ, ГСК
Декстраны	40–60 тыс.	Не исселедовано	А. М. Белоус и соавт. [1979]	КЭ и др.
Гидроксиэтилкрахмал (ГЭК)	60–120 тыс.	Не исселедовано	А. М. Белоус и соавт. [1979]	КЭ, КЛ, ГСК
ПЭО-400 (КСД) ПЭО-1500	400	12,5	В. М. Г учок [1977, 1980, 1981]	ГСК КЭ
Поливинилпирроли-дон (ПВП) Гемодез (КНК)	12–25 тыс 12 тыс.	Не исселедовано Не исселедовано	M. D. Persidsky [1966] Г. Т. Черненко [1999] С. С. Лаврик [1964–1975], П. М. Перехристенко и соавт. [1998]	КЭ, ГСК
ГМБТОЭМ (КСД)	378	15,5±0,6	Е. П. Сведенцов [1987, 2010]	ГСК, КТ, КЛ

Свойства криопротекторов с выраженным хладоограждающим действием на КДК и ЯККМ

Благодаря успехам, достигнутым в исследовании механизмов криозащиты КДК и ЯККМ, получили развитие трансфузии размороженных аутологичных, сингенных и аллогенных ГСК, КЭ и КТ с лечебной целью [1 2, 3]. Наряду с положительными результатами трансфузий криоконсервированных КДК и ЯККМ, описаны случаи токсичного воздействия такого вида гемотерапии на организм реципиентов [10]. Накопленный научный и практический опыт по криоконсервированию КДК и ГСК показывает, что до настоящего времени остается открытым вопрос о поиске нетоксичного хладоограждающего вещества,не дающего опасных для здоровья реципиентов побочных эффектов [3, 6].

Вопрос о том, какими свойствами должен обладать эффективный криопротектор до сих пор не имеет исчерпывающей оценки хотя некоторые из этих свойств известны [3]. В том числе:

• —    обладать способностью предупреждать развитие летальных криоповреждений форменных элементов, обеспечивать их сохранность в жизнеспособном состоянии после замораживания-отогревания и биологическую полноценность;

• —    быть нетоксичным, не требующим отмывания от размороженных клеток;

• —    хорошо растворяться в воде и стабилизировать молекулы воды;

• —    эффективно снижать количество вымораживаемой воды, способствовать образованию мелких кристаллов и стеклованию вне- и внутриклеточной воды;

• —    не откладываться (накапливаться) в клетках, тканях и органах макроорганизма;

• —    быстро выводиться из организма;

• —    не вызывать разрушения клеточных мембран и органелл;

• —    не приводить к развитию побочных эффектов: сенсибилизации, аллергии гипертермии,не изменять функцию эндокринной системы и репродуктивных органов;

• —    не должны иметь неприятного запаха не вызывать рвоту, не приводить к диарее;

• —    участвовать в метаболических процессах жизнеспособных клеток макроорганизма.

Вещество, обладающее перечисленными свойствами, предстоит искать либо среди уже существующих криопротекторов, либо синтезировать вновь, зная физико-химические особенности известных веществ [4]. Успех в целевых исследованиях может быть связан с представленным в данной работе материалом.