Антагонистический потенциал вторичных метаболитов грибов рода Trichоderma

Автор: Маркина О.А.

Журнал: Научный журнал молодых ученых @young-scientists-journal

Статья в выпуске: 1 (8), 2017 года.

Бесплатный доступ

В данной статье представлены результаты работы, целью которой являлось изучение действия вторичных метаболитов грибов рода Trichoderma в отношении вакцинного штамма Bacillusanthracis-55 ВНИИВВиМ. На основе результатов микробиологического тестирования нескольких штаммов грибов рода Trichoderma отобран штамм с наибольшим антагонистическим потенциалом, на основе проведенного скрининга по антибиотической активности метаболитов различных объектов выделения показано, что наиболее перспективным объектом для выделения вторичных метаболитов является мицелий микромицета Trichoderma. Обоснована перспективность продолжения исследований в этой области с целью обоснования возможности использования вторичных метаболитов исследуемых штаммов Trichodermaharzianum как сырья для новых микробиологических препаратов.

Еще

Грибы рода trichoderma, вторичные метаболиты, антагонистическая активность

Короткий адрес: https://sciup.org/14769835

IDR: 14769835

Текст научной статьи Антагонистический потенциал вторичных метаболитов грибов рода Trichоderma

Введение. На современном этапе развития сельского хозяйства изучение новых веществ с антимикробной активностью – одно из важнейших направлений преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов. В настоящее время число таких антимикробных препаратов постоянно увеличивается [10,16].

Мицелиальные грибы Trichoderma spp. стали широко применимы на сегодняшний день в биоинженерии, так как они достаточно полно удовлетворяют основным требованиям современной биотехнологии – это экономичность, экологичность, возможность масштабирования, краткосрочные ферментации и др [10]. Как известно, микромицет является продуцентом метаболитов, обладающих высокой антибиотической активностью в отношении грибов и бактерий. Исследования в этой области ведутся очень активно и постоянно находятся новые метаболиты с полезными свойствами [1, 4].

Грибы рода Trichoderma являются одними из наиболее часто используемых микробных агентов биологического контроля в сельском хозяйстве. В настоящее время они продаются как биопестициды, биоудобрения, усилители роста и стимуляторы естественной резистентности. Наибольшее биологическое и коммерческое значение имеют виды Trichoderma harzianum, Trichoderma hamatum и Trichoderma lignorum, а также их биотипы [9,11].

Микромицет синтезируют более 200 биологически активных веществ. Эти соединения могут быть разделены на летучие соединения – этилен, цианистый водород, спирты, альдегиды, кетоны – антибиотики, растворимые соединения в воде, пептаиболы, трихотеценовые микотоксины, более 100 метаболитов с антибиотической активностью (поликетиды, терпены и др.) [8,10,11]. Trichoderma viride, Trichoderma harzianum и Trichoderma konigii в состоянии производить 6-пентил-альфа-пироны – летучие антибиотики, играющие роль в бологичской борьбе с botrytis, fusarium. Пептаиболы – это полипептидные антибиотики, богатые непротеиногенными аминокислотами, обладают выраженной активностью против ряда грибов и грамположительных бактерий, а также против вирусов (Трихотоцин А и В) [2,15,16].

Их антимикробная активность связана с возникновением мембранной активности и способности образовывать поры в липидных мембранах. Что приводит к потере осмотического баланса и гибели клетки [2,11,15].

Многими исследованиями показана термостабильность экстрактов из Trichoderma. Это весьма важное обстоятельство, так как позволяет рассматривать экстракт, как самостоятельную субстанцию в создании лекарственных форм при создании биопрепарата для ветеринарии [2,6,7,12].

Экстракты из Trichoderma. (вторичные метаболиты), полученные разными способами культивирования, очевидно должны обладать разной биологической активностью [7,13,14].

Цель исследования – изучение действия вторичных метаболитов грибов рода Trichoderma в отношении вакцинного штамма Bacillus anthracis-55 ВНИИВВиМ , с целью обоснования возможности использования их как сырья для новых микробиологических препаратов.

Материалы, методы и результаты исследований. Исследование проводилось в лаборатории биотехнологии и молекулярной экспертизы Центра коллективного пользования «Орловский региональный центр сельскохозяйственной биотехнологии» ФГБОУ ВО Орловский ГАУ и на ФКП «Орловская биофабрика».

В качестве объектов исследования использовали штаммы грибов рода Trichoderma: Trichoderma harzianum (1) , выделенная из почв Орловской области; штаммы из коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ- Trichoderma harzianum Rifai (14), Trichoderma harzianum Rifai (20), Trichoderma virens (J.H. Mill, Giddenset A. A. Foster) Arx (D 2), Trichoderma virens (J.H. Mill, Giddenset A. A. Foster) Arx (D 15), Trichoderma virens (J.H. Mill, Giddenset A. A. Foster) Arx (D 25). Вторичные метаболиты получали по схеме, представленной на рисунке 1.

Рисунок 1 – Схема получения вторичных метаболитов Trichoderma

Тест-культурами являлись: Bacillus anthracis55 – ВНИИВВиМ, E. coli (Lac+), E. coli (Lac-), K. Pneumoniae, Staphylococcus aureus – суточные бульонные культуры.

Грибы рода Trichoderma культивировали на среде Сабуро поверхностным методом, на чашках Петри и методом глубинного культивирования в ферментере BiostatAplus (3 л) в течение пяти суток при температуре 25±2°С,рН 5,4, при 120 об./мин.

Определение бактерицидной активности исследуемых экстрактов осуществляли диско- диффузионным методом и методом агаровых блоков [7,8]. Оценку токсичности исследуемых штаммов проводили в отношении Tetrahymena pyriformis .

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Microsoft Office 2010 (Excel). Все опыты проводились в пятикратной повторности.

Результаты микробиологического тестирования штаммов грибов вида Trichoderma к Bacillus anthracis представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Результаты микробиологического тестирования штаммов грибов вида Trichoderma к Bacillus anthracis

Штамм грибов вида Trichoderma:	Зона угнетения роста Bacillus anthracis , мм
Trichoderma harzianum (1)	16±1,48
Trichoderma harzianum Rifai (14)	10±1,02
Trichoderma harzianum Rifai (20)	11±1,04
Trichoderma virens (J.H. Mill., Giddens et A.A. Foster) Arx (D 2)	6±0,25
Trichoderma virens (J.H. Mill., Giddens et A.A. Foster) Arx (D 15)	8±0,39
Trichoderma virens (J.H. Mill., Giddens et A.A. Foster) Arx (D 25)	8±0,77

В зависимости от ширины зоны угнетения роста микробных тест-объектов можно выделить высокую (от 11 до 20 мм) у Trichoderma harzianum (1), среднюю (в пределах 4-10 мм) у остальных штамм микромицета антагонистическую активность. Наибольшее антагонистическое действие в отношении Bacillus anthracis отмечено у штамма Trichoderma, выделенного из почв Орловской области. Результаты микробиологического тестирования местного штамма Trichoderma harzianum (1), показавшего наибольшее антагонистическое действие к условно-патогенным микроорганизмам представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты микробиологического тестирования местного штаммаTrichoderma harzianum (1) к условно-патогенным микроорганизмам

Условно-патогенные микроорганизмы	Диаметр зоны подавления роста, мм
E. coli (Lac+)	13±0,02
E. coli (Lac-)	9±0,06
K. pneumoniae	11±0,10
Staphylococcus aureus	12±0,08

В зависимости от ширины зоны угнетения роста микробных тест-объектов можно выделить высокую (от 11 мм) у , K. Pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli (Lac+), среднюю (в пределах 4-10 мм) у E. coli (Lac-) антагонистическую активность. Наибольшее антагонистическое действие штамма отмечено в отношении E. coli (Lac+) .

Таким образом, все изучаемые штаммы Trichoderma подавляют рост патогенной микрофлоры, хотя и в различной степени. Перспективным является исследование местного штамма микромицета на предмет биологической активности.

Для того чтобы рекомендовать тот или иной штамм в качестве продуцента биопрепарата или для биосинтеза активных антимикробных или противоопухолевых веществ, а также дальнейшего регламентирования биотехнологического штамма, обязательна оценка его токсичности. Биотестирование, проведенное на тест-объекте Tetrahymena pyriformis показало, что метаболиты штаммов, выделенные из различных объектов (мицелий, спорово-мицелиальная масса, культуральная жидкость) имеют различную токсичность (табл. 3).

Таблица 3 – Степень токсичности вторичных метаболитов штаммов грибов рода Trichoderma на тест-объекте Tetrahymena pyriformis

Объект выделения	Степень токсичности, %
	Через 60 мин.
Trichoderma harzianum (1)
Мицелий (глубинное культивирование)	Морфологических изменений нет, гибели нет
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	10
Культуральная жидкость	15
Trichoderma harzianum Rifai (14)
Мицелий (глубинное культивирование)	Морфологических изменений нет, гибели нет
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	12
Культуральная жидкость	11
Trichoderma harzianum Rifai (20)
Мицелий (глубинное культивирование)	Морфологических изменений нет, гибели нет
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	14
Культуральная жидкость	18
Trichoderma virens (J.H. Mill.,Giddens et A.A. Foster) Arx (D 2)
Мицелий (глубинное культивирование)	8
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	12
Культуральная жидкость	21
Trichoderma virens (J.H. Mill.,Giddens et A.A. Foster) Arx (D 15)
Мицелий (глубинное культивирование)	10
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	16
Культуральная жидкость	18
Trichoderma virens (J.H. Mill.,Giddens et A.A. Foster) Arx (D 25)
Мицелий (глубинное культивирование)	7
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	15
Культуральная жидкость	22

Так, самую высокую токсичность показали споровые экстракты и культуральные жидкости всех исследуемых штаммов микромицета (от 7 до 21%). Экстракты являются малотоксичными. Для определения наиболее перспективного объекта выделения вторичных метаболитов использовали диско-диффузионный метод определения чувствительности, основанный на способности антибактериальных препаратов диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов [4,5] . Результаты антибиотической активности вторичных метаболитов (различных объектов выделения) штаммов грибов рода Trichoderma на штамм Bacillus anthracis-55 ВНИИВВиМ in vitro представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Антибиотическая активность вторичных метаболитов штаммов грибов рода Trichoderma на Bacillus anthracis-55ВНИИВВиМ in vitro

Объект выделения	Зона подавления роста, мм
	Bacillus anthracis
Trichoderma harzianum (1)
Мицелий (глубинное культивирование)	19±0,35
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	16±0,88
Культуральная жидкость	14±0,36
Trichoderma harzianum Rifai (14)
Мицелий (глубинное культивирование)	14±0,68
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	11±0,36
Культуральная жидкость	12±0,25
Trichoderma harzianum Rifai (20)
Мицелий (глубинное культивирование)	15±1,05
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	12±0,69
Культуральная жидкость	11±0,25
Trichoderma virens (J.H. Mill.,Giddens et A.A. Foster) Arx (D 2)
Мицелий (глубинное культивирование)	11±1,05
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	8±0,54
Культуральная жидкость	7±0,36
Trichoderma virens (J.H. Mill.,Giddens et A.A. Foster) Arx (D 15)
Мицелий (глубинное культивирование)	12±0,25
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	9±0,21
Культуральная жидкость	7±0,68
Trichoderma virens (J.H. Mill.,Giddens et A.A. Foster) Arx (D 25)
Мицелий (глубинное культивирование)	11±0,36
Спорово-мицелиальная масса (поверхностное культивирование)	10±0,25
Культуральная жидкость	8±058
Амфотерицин (контроль)
Амфотерицин \	17±0,54

Экстракты вторичных метаболитов исследуемых штаммов (и из разных объектов выделения) проявляют антибиотическую активность в отношении тест-объектов. Наибольшее антагонистическое действие отмечено у вторичных метаболитов (из мицелия) местного штамма Trichoderma harzianum (1) – зона подавления роста патогенов составила 18-19 мм, больше чем в контроле.

Выводы. Показано, что все изучаемые штаммы Trichoderma подавляют рост Bacillus anthracis -55 ВНИИВВиМ при непосредственном их взаимодействии, Trichoderma harzianum (1) проявляет высокую антагонистическую активность, наиболее перспективным объектом для выделения вторичных метаболитов является мицелий микромицета Trichoderma. Проведена первичная токсикологическая оценка вторичных метаболитов грибов рода Trichoderma на Tetrahymena pyriformis . Самую высокую токсичность показали споровые экстракты и культуральные жидкости всех исследуемых штаммов микромицета (от 7 до 21%). Мицелиальные экстракты не токсичны. Обоснована перспективность продолжения исследований в этой области с целью обоснования возможности использования метаболитов исследуемых штаммов Trichoderma harzianum как сырья для новых микробиологических препаратов.

Список литературы Антагонистический потенциал вторичных метаболитов грибов рода Trichоderma

Александрова А.В. Ключ для определения видов рода trichoderma/Александрова А.В., Великанов Л.Л, Сидорова И.И.//Микология и фитопатология. 2006. Т. 40. № 6. С. 457-468.
Алимова С.Ф. Промышленное применение грибов Триходерма. Казань: «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина», 2006. 209 с.
Гнеушева И.А. Биологическая активность грибов рода Trichoderma и их промышленное применение/И.А. Гнеушева, Н.Е. Павловская, И.В. Яковлева//Вестник Орловского государственного аграрного университета. 2010. № 3. C. 36-39.
Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья. Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии //Минздрав РФ. Режим доступа: rosminzdrav.ru
Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. МУК 4.2.1890-04. М.: ФЦГ Минздрава РФ. 2004. 91 с.
Н.Е. Павловская. Метаболиты грибов рода Trichoderma -перспективные компоненты микробиологических препаратов для агротехнологий/Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, В.Н. Дедков, Н.И. Ботуз, А.В. Лушников, О.А. Маркина//Вестник ОрелГАУ. 2016. №2 (59). С.60-64
Павловская Н.Е. Изучение антибиотических свойств штаммов грибов рода Trichoderma в отношении патогенных микроорганизмов/Павловская Н.Е., Гнеушева И.А., Маркина О.А//Актуальные вопросы и перспективы развития математических и естественных наук: сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции. Омск: ИЦРОиН, 2015. С 66-69.
Павловская Н.Е. Экзометаболиты Trichoderma atrobrunneum как потенциальные биохимические агенты в агротехнологиях/Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева А.В. Лушников, О.А. Маркина, М.А. Полякова, И.Ю. Солохина. Научные труды V съезда физиологов СНГ, V съезда биохимиков России, Конференции ADFLIM. -Acta naturae/спецвыпуск том 2 под ред. А.И. Григорьева, Ю.В. Наточина, Р.И. Сепиашвили, А.Г. Габибова, В.Т. Иванова, А.П. Савицкого. 2016. С. 214-218.
Павловская Н.Е. Антагонистическая активность растительных метаболитов в отношении условно-патогенных микроорганизмов in vitro/Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева Л.В. Зомитева, И.Ю. Солохина//Актуальные вопросы и перспективы развития математических и естественных наук: сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции 7 мая 2015 г. Омск: ИЦРОиН, 2015. С.64-65.
Павловская Н.Е. Биологическая безопасность применения мицелиальных грибов Trichoderma spp. в современной биотехнологии/Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, А.В. Лушников, О.Г. Карначева//Современные тенденции развития науки и технологий: материалы 13 международной научно-практической конференции (Белгород, 30 апреля 2016 года). С. 100-101.
Павловская Н.Е. Перспективы применения мицелиальных грибов Trichoderma spp. В зоотехнии и ветеринарной медицине/Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, О.А. Маркина, А.В. Лушников//Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2016. № 12 С. 87-92.
Садыкова В.С. Экология грибоврода Trichoderma бассейна реки Енисей, их биологические свойства и практическое использование/Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва: МГУ, 2012. 46 с.
Шариков А.М. Выраженная антибиотическая активность грибов рода TRICHODERMA в отношении штамма BACILLUS ANTHRASIS СТИ-1//Научная перспектива. 2010. № 10. С. 92-93.
Adams, P. Trichoderma harzianum Rifai 1295-22 Mediates Growth Promotion of Crack Willow (Salix fragilis) Saplings in Both Clean and Metal-Contaminated Soil/P.Adams, F. A. A. M.De-Leij, J. M. Lynch//Microby Ecology.2007. Vol. 54.P. 306-313.
Degenkolb T., Gräfenhan T., Berg A., Nirenberg H.I., Gams W., Brückner H. Peptaibiomics: screening for polypeptide antibiotics (Peptaibiotics) from plant-protective Trichoderma species. Chem Biodivers 2006; 3: 593-610.
Hermosa R., Cardoza R., Rubio M., et al. Secondary metabolism and antimicrobial metabolites of Trichoderma/In: Biology and Biotechnology of Trichoderma. Elsevier. 2014. Vol. 125. P. 138.

Еще

Статья научная