Антибактериальные металлические покрытия титановых имплантатов на основе оксида серебра для борьбы с имплантат-ассоциированной инфекцией

Ортопедические конструкции, изготовленные из медицинского титана, широко используют для остеосинтеза и эндопротезирования суставов при оказании помощи пациентам с повреждениями и заболеваниями опорно-двигательного аппарата [1, 2]. Однако необходимо учитывать, что все имплантаты представляют собой инородные тела, создающие потенциальные условия для колонизации их поверхности различными видами бактерий и формирования биопленок, в том числе полимикробных [3–6].

Инфекции, связанные с установкой имплантатов, представляют собой серьезную проблему в медицине из-за высокой устойчивости сесильных форм бактерий к антибиотикам и возможности уклонения от действия факторов иммунной системы [6–8]. Имплантат-ассоциированная инфекция (ИАИ) является причиной значительной доли хронических и рецидивирующих инфекций, приводя к увеличению количества и сроков госпитализаций, а также финансовых затрат на лечение [8, 9].

Среди грамположительных патогенов в значительной доле случаев возбудителями ИАИ являются Staphylococcus aureus , грамотрицательных — Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa [9–11]. В 2024 году Всемирная организация здравоохранения отнесла их к одним из приоритетных бактериальных этиопатогенов. Данные виды бактерий демонстрируют высокий уровень устойчивости к антибактериальным препаратам, могут формировать биопленки на установленных конструкциях, проникать в клетки костной ткани, тем самым приводя к длительному течению инфекционного процесса и частым рецидивам [12–16].

В настоящее время значительное внимание уделяется поиску перспективных покрытий для модификации поверхности имплантата с целью обеспечить антибактериальные и антибиопленочные свойства и таким образом предупредить формирование микробного очага и развитие ИАИ [6, 16]. Наиболее часто в медицине применяют серебро и его соединения, в частности оксид серебра [4, 17, 18]. Резистентность патогенов к частицам металлов встречается крайне редко, что может быть объяснено мно-гонаправленностью действия соединений металлов, влияющих одновременно на несколько мишеней бактериальной клетки [19], поэтому разработка безопасных активных покрытий с частицами металлов является перспективной при борьбе с ИАИ.

Цель работы — оценить влияние состава и толщины многокомпонентных покрытий титановых 3D-сфер на наличие антибактериального действия и цитосовместимость.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В соответствии с разработанной ранее методикой (Евразийский патент № 049836 от 08.05.2025) комплексные покрытия оксидов серебра AgO/ZnO, AgO/MgO наносили на 3D-сферы из медицинского титана диаметром 5 мм (рис. 1). Опытные образцы взвешивали на аналитических весах до и после нанесения покрытия, после чего рассчитывали толщину в нм на площадь поверхности образца или образца свидетеля (см2) с учетом плотности напыляемого покрытия. Полученная толщина опытных металлических покрытий составила 230 нм и 80 нм.

Рис. 1. Пример готовых образцов 3D-сфер из титана с покрытием (толщина 230 нм) и без покрытия

Элементный состав полученных покрытий исследовали с помощью электронного микроскопа Hitachi TM4000Plus, оснащенного детектором EDS. Детектирование осуществляли по всей поверхности образца в нескольких точках, измеряя испускаемое рентгеновское излучение.

Сравнительную оценку антибактериальной активности полученных комплексов с оксидами серебра на поверхности образцов выполняли в жидкой питательной среде в отношении четырех эталонных штаммов бактерий: S. aureus ATCC 29213 (MSSA), S. aureus ATCC 43300 (MRSA), K. pneumoniae ATCC 33495 и P. aeruginosa ATCC 27853. В 3 мл бульона Мюллера – Хинтона (МХБ), содержащего 1 × 106 КОЕ/мл бактерий, погружали тестируемые образцы. Контрольными считали образцы без покрытий. Далее в течение суток пробирки инкубировали при температуре 37 °С. Из каждой пробирки инкубационные среды переносили в лунки 96-луночного планшета в четырех повторах и измеряли оптическую плотность (ОП) при 600 нм. Активность покрытий определяли по наличию статистически значимой разницы в значениях оптической плотности инкубационных сред с образцами с покрытием и без него.

Культивирование клеток линии Vero осуществляли в питательной среде DMEM, дополненной 10 %-ной фетальной бычьей сывороткой, а также пенициллином (100 Ед/мл) и стрептомицином (100 мг/мл). Субкультивирование проводили с интервалом три–четыре суток в соотношении 1:3. Для приготовления экстрактов образцы титановых сфер (с покрытиями AgO/ZnO, AgO/MgO и без покрытия) помещали в 3 мл культуральной среды и инкубировали в течение 24 часов при температуре 37 °C и скорости встряхивания 150 об/мин. Оценку цитотоксичности выполняли с помощью метилтетразолиевого теста (МТТ). Клетки засевали в 96-луночные планшеты по 2000 клеток в лунку. Через 24 часа культуральную среду заменяли на 200 мкл полученного экстракта, в качестве контроля использовали стандартную среду без экстракта. По истечении 72 часов инкубации в лунки вносили раствор МТТ в концентрации 1 мг/мл и инкубировали три часа. После этого среду удаляли, добавляли 100 мкл диметилсульфоксида и перемешивали в шейкере со скоростью 200 об/мин в течение пяти минут. Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре INNO-S при длинах волн 570 и 640 нм. Показатель жизнеспособности рассчитывали как отношение оптической плотности опытных образцов к контрольным значениям. Эксперимент повторяли три раза. Статистическая обработка полученных результатов выполнена в программе GraphPad Prism 9. Оценка антибактериальной активности многокомпонентных покрытий проведена с помощью анализа ANOVA, показатели жизнеспособности эукариотических клеток — t-тестом. Статистически значимыми считали значения p < 0,05.

Исследуемые покрытия на основе комплексов различных металлов были нанесены толщиной 230 нм и 80 нм, по данным весового метода, по стеклянному образцу-свидетелю. Содержание металлов на поверхности сфер: серебра — 62 %, цинка — 22 %, кислорода — 12 %, посторонние примеси отсутствовали (рис. 2). Аналогичные результаты получены при изучении состава образцов с покрытием AgO/MgO: содержание серебра — 39 %, магния — 11 %, кислорода — 16 % (рис. 3).

Установлено, что минимальная толщина нанесения многокомпонентного покрытия, содержащего в своем составе оксид серебра и оксиды цинка или магния, на поверхности титановых 3D-сферы обладает антимикробными свойствами против тестируемых штаммов бактерий (табл. 1, 2).

Выявленные статистически значимые отличия в оптической плотности между контрольными образцами и сферами с покрытиями AgO/ZnO или AgO/MgO указывают на широкий спектр антибактериального действия полученных металлических покрытий против тестируемых видов бактерий.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Рис. 2. Результаты элементного анализа поверхности титановых 3D-сфер с оксидами серебра и цинка

mass concentration [%)

О Mg Al S Ti Ag

10.97 9.78 1.50 0.66 31.77 45.33

15.09 11.63 1.15 0.56 32.11 39.45

14.63 10.44 1.69 0.52 35.95 36.77

21.30 10.80 0.84 0.83 30.47 35.77

15.50 10.66 1.29 0.64 32.58 39.33

4.29 0.77 0.38 0.14 2.36 4.29

2.14 0.39 0.19 0.07 1.18 2.15

Spectrum

LI 15026

LI 15027

LI 15028

LI 15030 Mean Sigma SigmaMean

Рис. 3. Результаты элементного анализа поверхности титановых 3D-сфер с оксидами серебра и магния

Таблица 1

Антибактериальная активность титановых 3D-сфер с покрытием AgO/ZnO (значения оптической плотности)

Штамм	3D-сферы с покрытием AgO/ZnO (230 нм)	3D-сферы с покрытием AgO/ZnO (80 нм)	3D-сферы без покрытия (контроль)
S. aureus ATCC 29213 (MSSA)	0,069 ± 0,002*	0,103 ± 0,019*	0,484 ± 0,025
S. aureus ATCC 43300 (MRSA)	0,084 ± 0,005*	0,112 ± 0,012*	0,522 ± 0,004
K. pneumoniae ATCC 33495	0,114 ± 0,008*	0,372 ± 0,008*	0,879 ± 0,015
P. aeruginosa ATCC 27853	0,101 ± 0,011*	0,366 ± 0,023*	0,996 ± 0,021

Примечание : * — в сравнении с контролем, p < 0,05

Таблица 2

Антибактериальная активность титановых 3D-сфер с покрытием AgO/MgO (значения оптической плотности)

Штамм	3D-сферы с покрытием AgO/MgO (230 нм)	3D-сферы с покрытием AgO/MgO (80 нм)	3D-сферы без покрытия (контроль)
S. aureus ATCC 29213 (MSSA)	0,059 ± 0,01*	0,323 ± 0,022*	0,484 ± 0,025
S. aureus ATCC 43300 (MRSA)	0,063 ± 0,005*	0,401 ± 0,015*	0,522 ± 0,004
K. pneumoniae ATCC 33495	0,055 ± 0,002*	0,269 ± 0,011*	0,879 ± 0,015
P. aeruginosa ATCC 27853	0,087 ± 0,009*	0,453 ± 0,044*	0,996 ± 0,021

Примечание : * — в сравнении с контролем, p < 0,05

Следует отметить, что покрытия толщиной 230 нм демонстрировали практически полное ингибирование роста биомассы бактерий, в то время как покрытия толщиной 80 нм характеризовались активностью меньшей выраженности. Также регистрировали, что при снижении толщины покрытия антибактери- альные свойства сохранялись, и все тестируемые образцы с покрытиями демонстрировали статистически значимое (p < 0,05) снижение биомассы бактерий.

Рис. 4. Жизнеспособность клеток Vero через три дня после инкубации с образцами экстрактов, * — p < 0,05)

Анализ цитосовместимости 3D-сфер с комплексными покрытиями показал зависимость жизнеспособности клеток Vero от толщины покрытия (рис. 4). Вне зависимости от состава изучаемых покрытий снижение их толщины в три раза повышало жизнеспособность эукариотических клеток. При этом минимальное влияние на жизнеспособность клеток установлено для сфер с покрытием AgO/MgO толщиной 80 нм.

ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка имплантатов с антимикробной активностью является одним из подходов к решению проблемы ИАИ. Соединения серебра зарекомендовали себя как превосходное противомикробное средство, способное бороться с бактериями, вызывающими инфекции как in vitro , так и in vivo , включая штаммы с множественной лекарственной устойчивостью [17, 19, 20, 21]. Кроме того, серебро в сочетании с другими соединениями демонстрирует выраженный синергидный эффект против различных видов патогенов [17, 21]. В работе E.D. Lopez Venditti et al. показано, что соединения серебра оказывают концентрационнозависимое антибактериальное действие в отношении грамотрицательных бактерий, а также ингибируют образование биопленок до 50 % у Escherichia coli и до 80 % у S. aureus за счет усиленного образования реактивных азотистых соединений в бактериальной клетке [18].

Помимо соединений серебра, доказанным антибактериальным эффектом при нанесении на поверхность биоимплантатов обладают ионы цинка и магния [22–26]. Отмечено, что соединения цинка, синтезированные экологически чистыми методами, характеризуются высокой биосовместимостью, что определяет их потенциальное биомедицинское применение [18, 22]. Соединения магния также характеризуются стабильностью, биосовместимостью и антибактериальным действием [23, 27]. W. Xiong et al. разработали остеокондуктивный материал, состоящий из частиц металлоорганических каркасов на основе магния, содержащий левофлоксацини и покрытый полидопамином. Авторы от- мечают, что разработанный ими материал комбинирует эффекты металлов и антибиотика для борьбы с резистентными патогенами, и его применение способствует регенерации костной ткани [27]. В нашем исследовании оба экспериментальных состава покрытий с оксидами серебра и цинка или магния продемонстрировали значимое снижение биомассы микробных возбудителей широкого спектра, включая MRSA, при этом антимикробная активность комплексного покрытия толщиной 80 нм была несколько меньшей в сравнении с покрытием толщиной 230 нм.

В настоящее время основным механизмом, определяющим наличие антибактериального эффекта соединений металлов, включая серебро, цинк и магний, считают значительное усиление окислительного стресса в бактериальных клетках [28–30]. Однако следует учитывать, что модификация имплантата должна быть безопасной для человека, способствовать усилению остеогенной функции остеобластов, повышать активность щелочной фосфатазы и способствовать синтезу коллагена и белка, не оказывая при этом негативного влияния на прочностные характеристики имплантата [31]. Нами установлено, что комплексы AgO/ZnO, AgO/MgO толщиной 230 нм, нанесенные на поверхность сфер, демонстрировали статистически значимое снижение жизнеспособности клеток Vero. Толщина покрытия 80 нм обеспечивала титановым сферам антибактериальное действие и не оказывала значимого цитотоксического действия на эукариотические клетки. При этом покрытие, содержащее магний, характеризовалось большей цитосовместимостью в сравнении с покрытием цинком. Кроме того, меньшая толщина покрытия при их потенциальном дальнейшем применении в клинической практике может способствовать снижению экономических затрат.

В дальнейшем необходимо изучить антибактериальное действие полученных антимикробных покрытий на основе комбинации оксида серебра с оксидом цинка или магния в отношении клинических изолятов грамотрицательных и грамположительных возбудителей ортопедической инфекции с различным профилем чувствительности к антибиотикам, а также оценить гистоморфологические реакции на имплантацию опытных образцов имплантатов лабораторным животным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многокомпонентные покрытия на основе оксидов металлов показали значительное антибактериальное действие широкого спектра, при этом уменьшение толщины наносимого слоя сохраняло антимикробные свойства и снижало цитотоксичность комплексов. Разработанные покрытия представляются крайне перспективными для дальнейших исследований с целью получения индивидуальных титановых ортопедических имплантатов с антибактериальными свойствами методом 3D-печати и использования их в клинической практике.