Антифунгальное действие перспективных штаммов грибных и бактериальных антагонистов на зооспорангии возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника

Введение. Ложная мучнистая роса (ЛМР), вызываемая облигатным паразитом оомицетом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni (син . Plasmopara helianti Novot . ), относится к числу наиболее вредоносных болезней подсолнечника. Решение проблемы защиты от болезней связано с разработкой комплекса мероприятий, включающих и микробиологический метод. В России нет микробиологических препаратов, зарегистрированных для защиты сельскохозяйственных культур от возбудителей ложной мучнистой росы. Однако исследования в области поиска биологических средств защиты растений от возбудителя этой болезни проводятся и в нашей стране, и за рубежом [1–6].

В лаборатории биометода Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур имени В.С. Пус-товойта (ФГБНУ ВНИИМК) в течение многих лет ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных культур от болезней. В последние годы проводится работа по поиску перспективных штаммов для созда-86

ния микробиопрепаратов против возбудителя ложной мучнистой росы [7; 8]. В результате ступенчатого скрининга штаммов антагонистов возбудителей болезней масличных культур из коллекции лаборатории выделено четыре перспективных штамма, обладающих максимальным защитным эффектом к возбудителю ложной мучнистой росы и другим, опасным патогенам (белой гнили, фомопсису и фузариозу), а также ростостимулирующей и колонизирующей активностью к культуре подсолнечника [9].

Создание эффективных микробиологических средств защиты растений предполагает изучение механизмов взаимодействия микробов-антагонистов с патогенами. Поэтому задачей исследования было изучить антифунгальное действие перспективных штаммов антагонистов в отношении возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника.

Материалы и методы. Объектом исследований служили штаммы грибов и бактерий ‒ антагонистов возбудителя ЛМР подсолнечника из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК: бактерии – Б-12 Bacillus licheniformis и Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens и грибы – T-2 Trichoderma sp. и Xk-1-4 Chaetomium olivaceum Cook et Ellis, а также смесь рас 330, 710 и 730, в соотношении 1 : 1 : 1, возбудителя болезни Plasmopara halstedii (Farl) Berl. et De Toni из коллекции лаборатории иммунитета ВНИИМК.

Так как возбудитель ложной мучнистой росы – облигатный паразит и не растёт на искусственных питательных средах, наша методика определения механизма действия штаммов антагонистов в отношении возбудителей болезней при прижизненном наблюдении на тонком слое твёрдой питательной среды [7] для Plasmopara halstedii не подходила. Нами разработана новая методика. Для этого бактериальные и грибные штаммы антагонистов выращивали на картофельноглюкозном агаре (КГА) в течение 5 и 10 суток соответственно [10; 11]. Температура выращивания штаммов оптимальная: для Б-12 Bacillus licheniformis – 30 оС, а для Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens, T-2 Trichoderma sp. и Xk-1-4 Chaetomium olivaceum – 25 оС. Затем культуру антагонистов с поверхности питательной среды, площадью 1 см2, смывали стерильной дистиллированной водой и смешивали в равной пропорции с суспензией зооспорангиев возбудителя ЛМР, полученной смывом спороношения с поражённых семядольных листьев проростков подсолнечника. Контроль – суспензия зооспорангиев возбудителя ЛМР, без добавления суспензий антагонистов. Для исследований использовали спороношение возбудителя ЛМР (на первые сутки проявления) на семядольных листьях проростков подсолнечника сорта ВНИИМК 8883. Под микроскопом «Motic BA 300» проводили наблюдения за суспензией зооспорангиев возбудителя ЛМР в контроле (сразу после смыва, через 1; 2,5; 4; 6 и 24 ч), а также в вариантах с добавлением суспензий антагонистов. Температуру в лаборатории в период наблюдений поддерживали в пределах 21 оС, среднюю для возбудителя ЛМР и антагонистов.

Результаты и обсуждение. В связи с тем, что наблюдения проводили за смесью трёх рас возбудителя ЛМР, установлено, что в контроле, сразу после смыва спороношения с листьев подсолнечника, зооспорангии были разных размеров и форм. В основном преобладали зооспорангии эллипсоидной и округлой формы, с хорошо заметным внутренним содержимым (протоплазмой), с неразрушенной оболочкой (рис. 1 а). Но встречались и отдельные зооспорангии с повреждённой оболочкой, из которых наблюдали выход протоплазмы, а также со сжатым содержимым (рис. 1 б).

а

Рисунок 1 – Зооспорангии возбудителя ложной мучнистой росы в контроле, сразу после смыва с семядольных листьев подсолнечника:

а) эллипсоидной и округлой формы, с неразрушенной оболочкой;

б) с повреждённой оболочкой, выходом (стрелка 1) и сжатием (стрелка 2) протоплазмы (ориг.)

Через 1,5–2,5 ч наблюдали выход зооспор возбудителя ЛМР и пустые зооспорангии. При этом в основном наблюдали выход крупных зооспор (размером 7,7– 8,4 × 9,2–9,9 мкм) по 8–10 и до 14 штук из одного зооспорангия (рис. 2 а). В одном случае из более мелкого зооспорангия наблюдали выход больше 100 штук мелких зооспор (размером 1,2–1,9 × 1,5–2,1 мкм) (рис. 2 б).

По данным Новотельновой (1966), количество зооспор в зооспорангиях возбудителя ЛМР подсолнечника, сформированных на листьях, составляет от 7–10 до 14 штук, реже больше, а на корнях – 10–18 и больше [12]. Из литературного обзора диссертации Ивебор (2009) [13] установлено, что, по данным зарубежных исследователей [14; 15], известно формирование более 30 зооспор в одном зооспорангии.

Рисунок 2 – Выход зооспор из зооспорангиев возбудителя ложной мучнистой росы в контроле через 1,5–2,5 ч после смыва с семядольных листьев проростков подсолнечника: а) крупные зооспоры;

б) мелкие зооспоры (ориг.)

Через 2,5–4 ч после смыва спороноше-ния возбудителя ЛМР с семядольных ли-88

стьев подсолнечника количество пустых зооспорангиев увеличилось и были отмечены проросшие зооспоры (рис. 3 а). При этом прорастали только более крупные зооспоры. Через 5–6 ч после смыва длина ростков зооспор увеличилась (рис. 3 б).

Следует подчеркнуть, что некоторые зооспорангии оставались выполненными в течение 24 ч и выхода зооспор из них не наблюдалось. Кроме того, нам не удалось увидеть проросшие мелкие зооспоры возбудителя ЛМР подсолнечника.

а

б

Рисунок 3 – Прорастание зооспор возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника в контроле после смыва спороношения: а) через 2,5–3 ч;

б) через 5–6 ч (ориг.)

При смешивании смыва спороношения возбудителя ЛМР с суспензиями спор грибов Xk-1-4 Chaetomium olivaceum и T-2 Trichoderma sp. уже в первые часы (1–2,5 ч) отмечено сжатие протоплазмы в большинстве зооспорангиев (рис. 4, 5). При этом эффект сжатия протоплазмы более ярко проявлялся под действием гриба Xk-1-4 Chaetomium olivaceum (рис. 4).

а протоплазмы в зооспорангиях сохранялся. Кроме того, отмечены, как и в контроле, выполненные зооспорангии. Выхода зооспор из зооспорангиев возбудителя ЛМР в вариантах с обоими грибными антагонистами не наблюдали.

а

Рисунок 4 – Зооспорангии возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника после смешивания с суспензией спор гриба Xk-1-4 Chaetomium olivaceum : а) через 1,5 ч; б) через 6 ч (стрелкой указаны зооспорангии со сжавшейся протоплазмой) (ориг.)

б

Рисунок 5 – Зооспорангии возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника после смешивания с суспензией спор гриба

T-2 Trichoderma sp.:

а) через 1 ч; б) через 6 ч (стрелкой указаны зооспорангии со сжавшейся протоплазмой) (ориг.)

В дальнейшем, в течение всего периода наблюдений (24 ч), эффект сжавшейся

При смешивании смыва спороношения возбудителя ЛМР с суспензиями бакте-89

рий из родов Bacillus (Б-12 B. licheni-formis ) и Pseudomonas (Sgrc-1 P. fluores-cens ) также отмечено сжатие протоплазмы зооспорангиев, но, в отличие от действия грибов-антагонистов, отмечен выход содержимого (рис. 6, 7).

б

Рисунок 6 – Зооспорангии возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника после смешивания с суспензией спор бактерии Б-12 Bacillus licheniformis:

а) через 1 ч (стрелкой указан зооспорангий со сжавшейся протоплазмой);

б) через 6 ч (стрелкой указана вышедшая протоплазма зооспорангия) (ориг.)

В обоих смесевых вариантах с бактериальными штаммами выхода зооспор не обнаружено.

а

б

Рисунок 7 – Зооспорангии возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника после смешивания с суспензией клеток бактерии Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens: а) через 1 ч (стрелкой указаны зооспорангии со сжавшейся протоплазмой);

• б)    через 6 ч (стрелкой указана протоплазма, вышедшая из зооспорангиев) (ориг.)

Следует подчеркнуть, что во всех смесевых вариантах антагонистов и возбудителя ложной мучнистой росы также, как и в контроле, многие зооспорангии возбудителя ЛМР оставались выполненными в течение 24 ч, но в вариантах с бактерия- ми, особенно из рода Pseudomonas, протоплазма отличалась более зернистой структурой (рис 8).

Рисунок 8 – Зооспорангии возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника через 24 ч после смешивания с суспензией клеток бактерии Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens

Заключение. Антифунгальное действие перспективных штаммов грибных и бактериальных антагонистов T-2 Tricho-derma sp., Xk-1-4 Chaetomium olivaceum, Б-12 Bacillus licheniformis и Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на зооспорангии возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника Plasmopara halstedii проявлялось в сжатии протоплазмы зооспорангиев, а у бактериальных штаммов ещё и её выходом. Во всех смесевых вариантах антагонистов и возбудителя ложной мучнистой росы также, как и в контроле, многие зооспорангии возбудителя ЛМР оставались выполненными в течение 24 ч, но в вариантах с бактериями, особенно из рода Pseudomonas, протоплазма отличалась более зернистой структурой. Не обнаружено    выхода    зооспор    из зооспорангиев возбудителя ЛМР во всех смесевых вариантах.

В контроле наблюдали выход зооспор по 8–10–14 штук (размером 7,7–8,4 × 9,2– 9,9 мкм) из одного зооспорангия, а в одном случае – более 100 штук (размером 1,2–1,9 × 1,5–2,1 мкм). Через 2,5–4 ч по- сле смыва спороношения отмечены проросшие более крупные зооспоры. Проросших мелких зооспор возбудителя ЛМР подсолнечника не наблюдали.

Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края, грант № 16-48230293.