Антигенные свойства белковых фракций ВЛКРС

ВЛКРС обладает выраженной антигенной активностью. В организме крупного рогатого скота антитела вырабатываются преимущественно на структурные белки вириона. У зараженных животных в крови циркулируют антитела к р24, р15, р12, р10, gp30 и gр51. Хотя и считается, что диагностическое значение имеют антитела против gр51 и р24 ВЛКРС, в количественном соотношении они могут коррелировать со стадией инфекционного процесса [1998]. Кроме того, доказано, что на разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота меняется и спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител, обнаруживаются антитела не только основным белкам вириона, но и продуктам их расщепления. Все эти данные свидетельствуют о необходимости комплексного подхода при определении как антигенов вируса, так и антител к ним в серологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Необходимо также отметить, что существующие методы диагностики не учитывают генетическое многообразие возбудителя болезни. По данным Хазипова Н.З. и др. (2011) в хозяйствах Республики Татарстан циркулируют подтипы 4 и 7 и обнаружен новый, ранее не изученный генотип.

Учитывая тот факт, что основным сдерживающим фактором при разработке иммунохимических методов анализа является качество используемого антигена, целью настоящей работы являлась изучение антигенных свойств белковых фракций ВЛКРС, выделенных из сыворотки крови инфицированных и больных лейкозом коров.

Материалы и методы. В работе использовали сыворотки крови крупного рогатого скота из неблагополучных по лейкозу хозяйств РТ; положительные и отрицательные контрольные сыворотки коммерческих наборов по определению антител к ВЛКРС методом ИФА; антиген вируса лейкоза для ветеринарного применения производства ФГУП «Курская биофабрика»; буферные растворы и реактивы для постановки ИФА; циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) выделяли методом преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ); иммуноферментный анализ ставили в непрямом варианте по методу, описанному Woller A. et al. (1976).

Результаты исследований и обсуждение. В настоящее время для изучения эпизоотической ситуации по инфекционным болезням в регионах и для их диагностики в мировой практике широко используются и разрабатываются различные экспресстест-системы.

Наиболее значимыми в разработке экспрес тестов для диагностики инфекционных болезней являются методы иммунохимического анализа. При этом применяются различные технологии, среди которых немало важную роль играют модифицированные методы ИФА в дот-блот варианте, а также иммуноблот анализ.

В своих прежних исследованиях нами установлено, что антиген ВЛКРС из набора для РИД исследований без дополнительной обработки не пригоден для дот-иммуноанализа. На полосках НЦМ проявлялись только едва заметные окрашенные пятна, по которым невозможно судить о характере иммунной реакции. Это связано с особенностями получения антигена, поэтому для применения его в дот-ИФА требуется дополнительная обработка, обеспечивающая более высокую степень чистоты.

При выделении антигена ВЛКРС из сывороток крови больных лейкозом коров исходили из того, что вирусные частицы главным образом содержатся в составе ЦИК. Технологию разрабатывали с учетом необходимости диссоциации ЦИК и избавления от сывороточных антител и всех остальных белков. На разработанный способ подана заявка для патентования.

Антигенные свойства выделенных белковых фракций вирусных частиц изучали в ИФА с использованием сывороток крови инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров из различных хозяйств Бавлинского, Лаишевского и Агрызского районов Республики Татарстан. Работа проводилась при поддержке ГУВ КМ РТ. Контрольным тестом служил – ИФА с использованием набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, произврдства НПО «Нарвак». Всего исследовали 52 пробы сыворотки крови. Каждая сыворотка исследовалась также против антигена для РИД анализа после специальной обработки. Полученные результаты представлены в таблице 1.

1. Показатели ОП в ИФА сывороток крови от инфицированных ВЛКРС коров СПК «Колос» Бавлинского района

По результатам исследований установили, что вирусные частицы выделенные из сывороток крови больных лейкозом коров, обладают антигенными свойствами и не уступают по специфичности антигену gp51 применяемых в коммерческих наборах для ИФА и тем более антигену для РИД анализов.

Из приведенных в таблице данных особый интерес представляют результаты исследований проб №№ 3, 7 и 8. Показатели оптической плотности (ОП) в ИФА у этих проб с исследуемым антигеном гораздо выше. Причем результаты ОП положительной контрольной сыворотки у данного антигена самая низкая: 1,873 против 1,956 у РИД-антигена и 2,108 – коммерческого набора.

Как известно, в тест-системах для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в основном используются белки оболочки вируса – gp51. Положительные контрольные сыворотки, соответственно получены против этого антигена.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый антиген является комплексным, содержащим различные белковые фракции вируса лейкоза. Как уже было сказано, спектр свободно циркулирующих в крови антител меняется с развитием инфекционного процесса. В связи с этим как можно более полное обнаружение антител к возбудителю становится определяющим фактором в диагностике заболевания.

Выводы. В сыворотке крови, в циркулирующих иммунных комплексах инфицированных ВЛКРС коров присутствуют различные белковые фракции вирионов. Разработанный способ позволяет их экстрагировать и использовать в качестве антигена в иммунохимических реакциях для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Преимущественной, отныне применяемых антигенов, его особенностью является то, что позволяет определять более полный спектр антител при инфекционном процессе и открывает новые перспективы для разработки новых более эффективных и информативных иммунохимических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

ЛИТЕРАТУРА: 1.Сюрин В.Н. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. – М.: МВА.1998. - С. 76-85. 2. Хазипов Н.З. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота по env-гену / Н.З.Хазипов, Р.Н.Вафин, А.М.Алимов и др.// Вестник Российской академии с/х наук. –2011. С.62-63. 3. Licursi M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts/ M.Licursi, Y. Inoshima, T. Yokoyama, E.T. Gonzalez // Virus Research 86 (2002), 101-110.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ ВЛКРС

Якупов Т.Р., Алимов А.М., Козлов А.С.

Резюме

Показана возможность выделения белковых фракций ВЛКРС из сыворотки крови коров, больных лейкозом. Разработанный способ позволяет их экстрагировать и использовать в качестве антигена в иммунохимических реакциях для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

ANTIGENIC PROPERTIES OF THE PROTEIN FRACTIONS BLV

Yakupov TR, Alimov AM, Kozlov AS