Антигрибная активность вытяжки листьев брусники в отношении возбудителя гнили земляники Rhizopus stolonifer

Известно, что листья брусники содержат вещества, обладающие высокой антибактериальной активностью [7]. Ранее нами была показана высокая эффективность водного экстракта листа брусники в предотвращении микробиологической порчи папоротника-орляка соленого [8, 9]. Настоящее исследование посвящено оценке возможности использования водного экстракта листьев брусники против возбудителя гнили земляники R. stolonifer .

Цель исследования: изучение антигрибной активности водного экстракта листьев брусники в отношении R. stolonifer .

Задачи исследования: проверка наличия антигрибного эффекта водного экстракта листьев брусники в отношении R. Stolonifer; изучение зависимости антигрибной активности от концен- трации экстракта; построение регрессионных моделей, описывающих зависимость антигриб-ного эффекта от концентрации экстракта.

Объекты и методы исследования . В качестве тест-объекта использован штамм   R.

stolonifer , выделенный из пораженной текучей гнилью земляники садовой на гидропонной установке в Институте агроэкологических технологий ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ (рис. 1, 2).

Рис. 1. Спорангии R. stolonifer (ширина линейки 1 мм)

Рис. 2. Споры R. stolonifer (ширина линейки 10 мкм)

Для приготовления водного экстракта использовали лист брусники сухой производства «ФармаЦвет» (13 % влажность). Листья брусники в количестве 135 г/л настаивали в жидкой среде Чапека-Докса в течение 4,5 ч на водяной бане при 50 °С. Дозировка листьев и способ приготовления вытяжки были выбраны на основе предыдущих экспериментов по изучению антимикробных свойств листа брусники в отношении микроорганизмов, вызывающих порчу папоротника-орляка соленого.

Для проверки антигрибных свойств вытяжки листьев брусники использовали тест, основанный на прорастании спор [10]. Полученный настой смешивали с суспензией спор R. stolonifer в жидкой среде Чапека-Докса в соотношении 1:1, после чего готовили серию разведений полученной смеси с использованием той же суспензией спор R. stolonifer. Контролем служила суспензия спор R. stolonifer в жидкой среде Чапека-Докса без добавления вытяжки листьев. Эксперимент проводили в плашках для иммунофер-ментного анализа, по 20 мкл суспензии в ячейке. После заполнения ячеек плашку инкубировали в течение 12 ч во влажной камере при температуре +24 °С, после чего подсчитывали число проросших и непроросших спор в каждом варианте. Подсчет проросших и непроросших спор проводили по микрофотографиям (рис. 3).

Общее число подсчитанных спор в вариантах составило от 359 до 944 шт. (табл. 1).

Рис. 3. Проросшая (1) и непроросшая (2) споры R. stolonifer (стрелкой показана проростковая гифа; ширина линейки 10 мкм)

Схема эксперимента

Таблица 1

Разведение исходной вытяжки, раз	Концентрация в пересчете на сухой лист брусники, г/л	Общее число подсчитанных спор, шт
Контроль	0	585
2	67,500	359
4	33,750	854
8	16,875	647
16	8,438	944
32	4,219	490
64	2,109	682
128	1,055	525
256	0,527	628

Микрофотосъемку выполняли с помощью микроскопа «Микмед-6» вар. 3, оснащенного цифровой камерой DCM-130E.

Статистическую значимость различий по прорастанию спор между вариантами опыта и контролем определяли на основе точного F-теста для таблиц 2 × 2 с использованием пакета StatSoft STATISTICA 6.0. Для множественного сравнения применяли критерий хи-квадрат. Подбор уравнений регрессии и определение коэффициентов в этих уравнениях проводили с

Влияние разных концентраций водной вытяжки листьев брусники на прорастание спор R. Stolonifer

Таблица 2

Разведение исходной вытяжки, раз	Прорастание, % к контролю	Значимость различий с контролем p
Контроль	100,0	–
2	16,7	< 0,001
4	21,5	< 0,001
8	16,2	< 0,001
16	27,8	< 0,001
32	37,5	< 0,001
64	40,1	< 0,001
128	37,9	< 0,001
256	81,2	< 0,05

В то же время в интервале разведений исходной вытяжки в 2–8 раз доля выживших спор практически не меняется, варьируя в пределах 16,2–21,5 %. Сравнение этих вариантов по критерию хи-квадрат не выявило между ними статистически значимых различий.

Регрессионный анализ показал, что зависимость доли погибших спор R. stolonifer от концентрации вытяжки листьев брусники носит характер кривой с насыщением и адекватно (с коэффициентом детерминации R² = 0,997) может быть описана суммой двух логистических функций F1 и F2, каждая из которых имеет следующий вид:

помощью модуля User-specified regression (Пользовательская регрессия), входящего в пакет StatSoft STATISTICA 6.0.

Результаты исследования. Водная вытяжка листьев брусники оказала ярко выраженный антигрибной эффект в отношении R. stolonifer . Статистически значимое снижение прорастания спор в сравнении с контролем отмечено даже при разведении исходной вытяжки в 256 раз (табл. 2).

Y = Y max---

1 + e

^, k ■ ( X - X 0 )

где Y – доля погибших спор, %; Y max – максимально возможная доля погибших спор, %; X – концентрация вытяжки, г/л в пересчете на сухой лист; X 0 – концентрация вытяжки, при которой доля погибших спор равна 1/2 от Y max; k – коэффициент.

Результаты подбора параметров для функций F1 и F2 представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты подбора параметров для функций F1 и F2

Параметр	F1	F2
Y max	61,04177	20,80989
X 0	0,539532	8,228941
k	66,9231	0,739612

Можно предположить, что указанные функции соответствуют двум разным химическим соединениям с антифунгальной активностью, входящим в состав вытяжки. Первое соединение, которому соответствует функция F1, ответственно за гибель 61 % спор в эксперименте.

Второе соединение, которому соответствует функция F2, ответственно за гибель 20,8 % спор. Ниже представлены теоретические кривые для функций F1 и F2, а также кривая для суммы функций F1+F2 (рис. 4–6).

Концентрация вытяжки в пересчёте на сухой лист, г/л

Рис. 4. Теоретическая кривая для функции F1

Концентрация вытяжки в пересчёте на сухой лист, г/л

Рис. 5. Теоретическая кривая для функции F2

♦ Экспериментальные значения   ^^^м Теоретические значения

Рис. 6. Теоретическая кривая для суммы функций F1+F2 и экспериментальные значения

Следует отметить, что около 17 % спор выживали даже при максимальной испытанной концентрации вытяжки листьев брусники (67,5 г/л в пересчете на сухой лист), причем характер экспериментальной и теоретической зависимости говорит о том, что использовать вытяжку с концентрацией выше 17–20 г/л в пересчете на сухой лист не целесообразно.

Тем не менее, несмотря на отсутствие полного подавления R. stolonifer в нашем эксперименте, эффективность водной вытяжки листа брусники оказалась сопоставимой с эффективностью других природных антигрибных средств, изученных в работах [5] и [6].

Заключение. Изучение влияния водной вытяжки листа брусники на прорастание спор возбудителя гнили земляники R. stolonifer показало, что эта вытяжка оказывает статистически значимое ингибирующее воздействие на данный гриб уже в концентрации 0,53 г/л в пересчете на сухой лист. Максимальный антигрибной эффект достигается при концентрации вытяжки около 17 г/л в пересчете на сухой лист, после чего кривая «доза-эффект» выходит на плато. Регрессионный анализ показал, что наблюдаемая зависимость доли погибших спор от концентрации вытяжки адекватно описывается суммой двух логистических функций, что позволяет предположить наличие в вытяжке двух разных веществ, обладающих антифунгальной активностью в отношении R. stolonifer. Несмотря на ярко выраженный антифунгальный эффект, вытяжка листа брусники не обеспечивает полного подавления R. stolonifer. В этой связи данную вытяжку можно рекомендовать в качестве дополнительного средства борьбы с R. stolonifer в сочетании с другими мерами по защите урожая от данного гриба.