Антиоксидантная система и маркеры окислительного стресса при раке почки

В последние годы широкое признание получила свободнорадикальная теория канцерогенеза. Активные формы кислорода (АФК), вызывая генетические мутации, способствуют инициации процессов дедифференцировки, одновременно играя существенную роль на всех этапах канцерогенеза. При этом каждый вид опухоли имеет свои индивидуальные особенности нарушения метаболизма АФК [3, 15]. В этом отношении почечноклеточный рак (ПКР) не является исключением. Факторы риска развития ПКР разнообразны: курение, ожирение, профессиональные вредности (асбест, тяжелые металлы), повышенное давление, диабет, алкоголь, оральные контрацептивы, анальгетики. Среди вышеперечисленных факторов имеются как повышающие интенсивность перекисных процессов, так и обладающие антиоксидантным воздействием, что в любом случае ведет к нарушению баланса между про- и антиоксидантами [10, 13].

Процесс неферментативного перекисного окисления липидов (ПОЛ) представляет собой взаимодействие свободных радикалов с липидными компонентами мембран и липопротеинов. В живых системах такими радикалами являются АФК, источники которых разнообразны, некоторые из них являются побочными продуктами нормальных физиологических процессов: работа дыхательной цепи митохондрий, действие оксигеназ и некоторых дегидрогеназ; другие – результат патологического влияния извне: ионизирующее излучение, влияние металлов переменной валентности. Наряду с этими механизмами существуют системы целенаправленной наработки АФК, к ним можно отнести НАДФН-оксидазы фагоцитирующих клеток. Во время «респираторного взрыва» фагоцитирующие клетки крови продуцируют огромное количество АФК, внося большой вклад в свободнорадикальное окисление [1].

Целью исследования явилось изучение уровня продукции АФК нейтрофилами, содержание продуктов ПОЛ и состояние антиоксидантной системы крови больных ПКР до и в динамике после хирургического лечения.

Материал и методы

В Красноярском краевом клиническом онкодиспансере под динамическим наблюдением находилось 150 пациентов с местнораспространенным ПКР в возрасте 50–70 лет, у которых проводилась оценка вышеуказанных показателей в следующие сроки: до операции (n=88); на первые (n=30); третьи (n=25) и седьмые (n=42) сут после радикальной нефрэктомии. Группу контроля составили 40 практически здоровых человек.

Забор крови производили из локтевой вены натощак, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. Из полученной крови выделяли плазму, эритроциты и лейкоцитарную взвесь. В плазме и эритроцитах проводилось определение продуктов перекисного окисления липидов: диеновых конъюгатов (ДК), метаболитов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) – ТБК-активных продуктов (ТБКП) и оценивалось состояние антиоксидантной системы по активности антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ). В лейкоцитарной взвеси – спонтанная и индуцированная хемилюминесценция нейтрофильных гранулоцитов. Поскольку остальные лейкоциты обладают ничтожно малой способностью к хемилюминесценции, то специального отделения фракции нейтрофильных гранулоцитов не производилось [7].

В данном исследовании для оценки выработки АФК нейтрофилами использованы два хемилюминесцентных зонда: люцигенин, преимущественно взаимодействущий с супероксидным анионом, люминол – с перекисью водорода и гидроксильным радикалом. Таким образом, оценивается образование первичных и вторичных АФК соответственно. В качестве индуктора «респираторного взрыва» был использован опсонизированный зимозан. Суммарное количество АФК, образовавшихся в ходе реакции определялось по площади хемилюминесцентной кривой [7].

Об уровне ДК судили на основании спектрометрии гептан-изопропанолового экстракта эритроцитов при длине волны 233 нм [6]; ТБКП – по образованию окрашенных продуктов с ТБК при длине волны 532 нм [14]. Принцип метода определения активности СОД основан на ингибировании реакции автоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии супе-роксиддисмутазы при длине волны 347 нм [5]. Активность каталазы определяли по образованию окрашенного в желтый цвет комплекса не разрушенной в ходе каталазной реакции перекиси водорода с молибдатом аммония [2].

Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха (С25 и С75). Проверку гипотезы о статистической достоверности выборок проводили с помощью критерия Манна–Уитни. Статистический анализ производился с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Установлено, что уровень спонтанной выработки как первичных, так и вторичных АФК нейтрофильными гранулоцитами, увеличен в течение всего периода наблюдения (табл. 1). При этом уровень выработки первичных АФК нарастает и к 7-м сут достигает максимального уровня. Аналогичная картина наблюдается при индукции «респираторного взрыва» зимозаном – высокий уровень продукции первичных и вторичных АФК весь наблюдаемый период с максимумом на 7-е сут (табл. 2).

При раке почки также отмечается увеличение относительного и абсолютного количества нейтрофильных гранулоцитов [7]. Данные обстоятельства могут способствовать значительному усилению окислительного стресса в крови пациентов. Исследования содержания продуктов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной системы являются довольно распространенным способом оценки окислительного стресса организма.

В ходе исследования было выяснено, что содержание первичных продуктов ПОЛ в плазме повышено в течение всего периода наблюдения (табл. 3). Относительно вторичных продуктов ПОЛ повышенный уровень отмечается до операции и на 3-и сут послеоперационного периода (ПОП). Таким образом, можно говорить об ин-

тенсивно протекающем перекисном окислении    содержание ДК, тогда как содержание малоно- липидов плазмы крови.                           вого диальдегида резко снижается, 3-и сут ПОП В эритроцитах больных ПКР до операции    характеризуются нормализацией показателей отмечается несколько сниженное относительно     перекисного окисления липидов, но к 7-м сут контрольных величин содержание ТБКП. На    содержание первичных продуктов ПОЛ снова первые сутки после операции увеличивается     возрастает (табл. 4). Таблица 1 Уровень спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов крови больных раком почки
Показатели	Контроль	До операции	1-е сут	3-е сут	7-е сут
Максимальная площадь свечения, люцигенин, о.е ×105	0,14 0,08–0,21	0,64* 0,23–1,25	0,43* 0,12–2,63	0,67* 0,14–3,94	1,05* ** *** 0,61–2,5
Максимальная площадь свечения, люминол, о.е ×105	0,51 0,24–1,00	1,9* 0,84–8,89	4,01* 0,94–7,46	3,33* 0,45–9,2	2,79* 1,37–4,65

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контролем (р=0,05); ** – различия статистически значимы по сравнению с аналогичными показателями до операции (р=0,05); *** – различия статистически значимы по сравнению с аналогичными показателями на 1-е сут после операции (р=0,05).

Таблица 2

Уровень индуцированной зимозаном хемилюминесценции нейтрофилов крови больных раком почки

Показатели	Контроль	До операции	1-е сут	3-е сут	7-е сут
Максимальная площадь свечения, люцигенин, о.е ×105	0,41 0,19–0,54	0,95* 0,41–1,98	1,61* 0,41–4,02	2,33* 0,23–8,58	3,47* ** *** 2,5–9,03
Максимальная площадь свечения, люминол, о.е ×105	2,05 1,02–4,1	5,86* 2,3–14,0	11,1* 4,32–19,3	9,43* 1,67–14,6	10,0* ** *** 4,99–26,2

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контролем (р=0,05); ** – различия статистически значимы по сравнению с аналогичными показателями до операции (р=0,05); *** – различия статистически значимы по сравнению с аналогичными показателями на 1-е сут после операции (р=0,05).

Таблица 3

Уровень продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови больных раком почки

Показатели	Контроль	До операции	1-е сут	3-е сут	7-е сут
ДК, ммоль/л	0,38 0,29–0,54	0,72* 0,38–1,27	0,79* 0,38–2,02	0,56* 0,42–1,93	1,22* 0,43–2,05
ТБКП, мкмоль/л	1,6 0,96–2,24	1,92* 1,28–3,14	2,43 1,28–2,88	2,24* 1,66–2,56	1,83* 1,28–2,24

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контролем (р=0,05).

Таблица 4

Уровень продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах больных раком почки

Показатели	Контроль	До операции	1-е сут	3-е сут	7-е сут
ДК, мкмоль/г Hb	1,74 0,89–4,11	1,6 0,99–3,105	3,71* ** 1,54–8,93	2,32 1,4–6,01	6,0* ** 2,27–8,62
ТБКП, нмоль/г Hb	11,36 9,14–15,82	9,93* 7,47–13,3	6,452* ** 4,84–13,69	8,8 6,92–14,17	10,83 6,97–15,04

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контролем (р=0,05); ** – различия статистически значимы по сравнению с аналогичными показателями до операции (р=0,05).

Первичные продукты ПОЛ являются основными факторами повреждения мембран в результате окислительного стресса, которые могут существенно снизить функциональные возможности клетки [1]. Существуют экспериментальные данные о неоднозначности уровня ТБКП при различных видах онкологических заболеваний, характерны как повышенные, так и пониженные значения данного показателя [8, 9, 12, 16]. Альдегидные и кетонные продукты ПОЛ обладают высокой способностью связываться с белками, образуя основания Шиффа, а также подвергаться метаболизму под действием неспецифической адегиддегидрогеназы [11]. Эти механизмы способны значительно снизить долю свободного ТБКП как в плазме, так и в эритроцитах.

В плазме крови активности СОД и КАТ имеют разнонаправленную динамику. Существенно снижена активность СОД и повышена КАТ (табл. 5). СОД в плазме крови представлена особой формой экстрацелюлярной СОД, которая синтезируется и выделяется клетками эндотелия сосудов. Внутриклеточные формы СОД вклада в супероксиддисмутазную активность не вносят, так как вне клетки быстро подвергаются деградации. Данный фермент представлен тремя фракциями, различающимися сродством к гликокаликсу клеток эндотелия и внеклеточному матриксу. Форма, не связанная с эндотелием сосудов, составляет около 10 % от общего количества фермента [3]. Следовательно, по изменению активности данного фермента в плазме крови трудно судить о величине его синтеза. Можно предположить, что снижение активности СОД в плазме произошло как за счет снижение доли свободной формы, так и за счет инактивации фермента АФК.

В отличие от СОД, КАТ собственной внеклеточной формы не имеет, поэтому активность данного фермента в плазме крови представлена КАТ, вышедшей из клеток в результате их повреждения или разрушения. Сохраняя свою активность, КАТ может способствовать компенсации окислительного стресса в плазме крови.

Дооперационный и ранний послеоперационный периоды характеризуются повышенными активностями СОД и КАТ в эритроцитах (табл. 6). Данные ферменты являются первым звеном защиты от свободнорадикального окисления, устраняя активные формы кислорода – супероксидный радикал и перекись водорода [1, 3]. Доказано, что под действием активных форм кислорода в клетках происходит активация экспрессии редокс-чувствительных генов [4]. Поскольку эритроцит не имеет белоксинтезирующего аппарата, можно говорить об активации данных генов на уровне ядерных предшественников эритроцита. Повышение активности СОД и КАТ в эритроцитах может являться компенсаторным механизмом защиты клеток от окислительного стресса.

Полученные в ходе исследования данные говорят об усилении свободнорадикального окисления в крови больных ПКР за счет усиленной наработки

Таблица 5

Активность супероксиддисмутазы и каталазы в плазме крови больных раком почки

Показатели	Контроль	До операции	1-е сут	3-е сут	7-е сут
СОД, ед/мин × мл	204,41 151,05–250,32	90,93* 57,75–160,48	58,99* 37,02–141,62	130,1* 105,06–160,52	84,51* 45,88–189,7
КАТ, мкмоль/с × мл	0,27 0,16–0,39	0,67* 0,43–1,63	0,6* 0,45–0,84	0,68* 0,66–0,93	0,44* 0,27–0,95

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контролем (р=0,05).

Таблица 6

Активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах крови больных раком почки

Показатели	Контроль	До операции	1-е сут	3-е сут	7-е сут
СОД, ед/мин × г Hb	1917 1668–2372	2555* 2114–2904	2337* 2029–2558	2459* 2282–2814	2589* 2427–3222
КАТ, мкмоль/с × г Hb	1,77 1,41–2,03	2,09* 1,9–2,34	1,82 1,7–2,08	2,06* ** 1,94–2,28	2,18* 1,99–2,45

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контролем (р=0,05); ** – различия статистически значимы по сравнению с аналогичными показателями на 1-е сут после операции (р=0,05).

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2012. № 5 (53)

АФК нейтрофильными гранулоцитами. Несмотря на умеренное и даже сниженное содержание ТБКП, стабильную активность СОД и КАТ, но учитывая высокое содержание ДК как в плазме, так и в эритроцитах, можно предполагать преобладание окислительных процессов. Длительное протекание окислительного стресса может привести к постепенному истощению возможностей антиоксидантной системы, что, в свою очередь, приведет к срыву адаптационных механизмов организма и может увеличить риск послеоперационных осложнений. Нельзя не отметить, что наибольшие изменения и наибольший сдвиг в системе про- и антиоксидантов наблюдается в плазме крови, тогда как показатели в эритроцитах более стабильны. Исходя из этого, можно говорить о наибольшей информативности плазмы для исследований редокс равновесия в крови больных ПКР.