Антиоксидантные свойства функциональных пищевых ингредиентов, используемых при производстве хлебобулочных и молочных продуктов, их влияние на качество и сохраняемость продукции

УДК 664.665 + 637.146.344DOI:

Вопросы антиоксидантной активности (АОА) пищевых ингредиентов (ПИ), их количество и качество в продуктах питания в настоящее время приобретают новый этап интереса производителей. Раскрытие механизмов антиоксидантного действия на клеточные системы позволяет регулировать общий антиоксидантный статус организма человека, минимизировать негативное действие свободных радикалов. Доказано, что триггерным фактором развития неинфекционных заболеваний (НИЗ) человека является оксидативный стресс (Европейское региональное бюро ВОЗ, Копенгаген, 2012), сопровождающийся повреждением белков, липидов и ДНК. Разработанный Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) документ «Глобальный план действий по профилактике неинфекционных заболеваний и борьбе с ними на 2013–2020 гг.», указывает, что одним из рычагов в решении проблемы является рационализация питания, направленная на повышение устойчивости организма человека к действию стрессоров [2].

Среди свойств биологически активных ПИ выделенных из растений особое место отводится изучению АОА их экстрактов, так как предполагается, что высокая АОА вносит существенный вклад в их функциональные свойства. Антиоксиданты блокируют процесс окисления путем нейтрализации свободных радикалов, но при этом сами начинают подвергаться процессам окисления, а значит, существует необходимость восполнения окислительных ресурсов организма. В связи с чем, применение пищевых ингредиентов, обладающих антиоксидантными свойствами, в производстве хлебобулочных и молочных продуктов позволит обеспечить их функциональность с точки зрения повышения устойчивости организма к НИЗ. На наш взгляд, особый интерес представляет изучение возможности участия растворимых углеводов в нейтрализации оксидативного стресса в качестве низкомолекулярных перехватчиков активных форм кислорода (АФК).

Выбор фукоидана в качестве функционального пищевого ингредиента обусловлен комплексностью его свойств и значительной доказательной базой в части исследований в этом направлении. Фукоиданы – это сульфатированные полисахариды, привлекающие внимание ученых из-за их антираковых, антитромбических, антикоагулянтных и антивирусных свойств. Установлено, что фукоиданы предохраняют растения, произрастающие на литорали, от высыхания и обеспечивают стабильность клеточных стенок. Благодаря своим антиоксидантным свойствам фукоиданы могут защищать растения в естественных условиях от стресса, вызванного флуктуациями температуры, света, солености воды и других факторов. Сульфатированные полисахариды являются пищевыми волокнами, поэтому их можно применять практически без ограничений, не вызывая заметных нежелательных реакций [7, 8, 14].

Непременным и часто главным компонентом молекул фукоидана служат остатки сульфатированной α-L-фукозы. В их составе обнаружены и другие моносахариды: галактоза, манноза, ксилоза, уроновые кислоты, а также ацетильные группы. Родственные биополимеры обнаружены в некоторых морских беспозвоночных (морских ежах и голотуриях), принадлежащих к типу иглокожих. Полисахариды животного происхождения содержат только фукозу и сульфатные группы, и, соответственно, представляют собой сульфатированные α-L-фуканы, построенные из повторяющихся тетрасахаридных блоков. В наземных организмах полисахариды, подобные фукоиданам, до сих пор не обнаружены [12, 13, 16]. Структурные характеристики и количество сульфатов (таблица 1) некоторых фукоиданов, выделенных из разных видов бурых водорослей, значительно различаются и, следовательно, могут обладать разной функциональностью.

Таблица 1.

Структурные характеристики некоторых фукоиданов бурых водорослей

Table 1.

Structural characteristics of some fucoidans of brown algae

Бурая водоросль Kelp	Моносахаридный состав / Monosaccharide composition Fuc: Glc: Gal: Man: Xyl: Ram: Gl сА	Количество сульфатов Sulfur content	Источник Reference
Laminaria japonica	*1,0:0,07:0,37:0,09:0,14:0,02:0,21	*1,66	[11]
Undaria pinnatifida	*а) 1,0:0:0,77:0,04:0,03:0:0,33 *б) 1,0:0:0,87:0,03:0,04:0:0,12 *в) 1,0:0:1,76:0,04:0,08:0,17	*0,32 *1,12 *3,37	[17]
Undaria pinnatifida	*1,0:0:1,1:0:0:0:0:0	*0,72	[13]
Fucus evanescens	º**а) 58,7:0:1,6:0:1,6:0:0:0 **б) 35,4:4:0:0,8:6,1:0:н.о **в) 10,7:1,1:3:3,7:17,4:0:15,6 **г) 33,2:0:4,5:3,5:8,1:0:28,9 **д) 34:0:5,4:0:3,8:0:32,5	**46,5 н.о **19,6 **28,9 **32,5	[9]

* – мольные отношения; ** – процентное содержание; н.о – не определено; º** – для этой фракции получен ЯМР-спектр [* – molarratio; ** – percentage; n.d – notdetermined; º** – forthisfractionofthereceivedNMR]

Учеными доказана способность фукоидана бороться с агрессивными окислителями. Так в 2016 году корейские медики обнаружили, что это вещество при нанесении на кожу ускоряет производство кератиноцитов (клетки, составляющие наружный покров организма) и укрепляет эпидермис, снижая негативное воздействие ультрафиолетового излучения. В процессе перорального приема наблюдается положительная динамика выработки гемоксигеназы и супероксид-дисмутазы, которые защищают внутриклеточное пространство от проникновения свободных радикалов, превращая их в обычные молекулы кислорода [15, 19–22].

Важную роль в антиоксидантной активности полисахаридов играет их молекулярная масса, причем способность блокировать свободные радикалы увеличивается с уменьшением молекулярной массы [18, 20]. Установлено, что АОА фукоиданов водоросли Laminaria japonica обусловлена комплексом факторов – величиной молекулярной массы, типом доминирующего сахара, степенью разветвления и общим содержанием сульфатных групп, а также содержанием глюкуроновой кислоты, фукозы и нейтральных сахаров [10, 18].

Следует отметить, что при обогащении продуктов питания, как правило, осуществляют модификацию традиционных рецептур за счет внесения пищевых ингредиентов. Таким образом, регулируется химический состав готовых изделий, а также их функциональные свойства. Применение гидробионтов, в частности водорослей, и извлеченных из них ингредиентов, становится весьма актуальным, особенно для регионов, удаленных от приморских и океанических акваторий.

Целью данного исследования являлось установление антиоксидантной активности ПИ, содержащих фукоидан, используемых в качестве обогатителей хлебобулочных и молочных продуктов, и оценка их влияния на качество и сохраняемость изделий.

Материалы и методы

Выбор объектов и методов эксперимента определен целью исследований.

На первом этапе исследований в качестве объектов использовали ПИ, содержащие фукоидан различной чистоты от разных производителей:

• •    ПИ № 1 – БАД к пище «Фуколам-С-сы-рье» (ТУ 9284–067–02698170–2010), разработанная учеными лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии (ТИБОХ) ДВО РАН по оригинальной технологии, защищенной патентом (Пат. № 2315487). Сырьем для получения БАД являются бурые

водоросли – фукус исчезающий ( Fucus evanescens ) с содержанием фукоидана не менее 60% и альгинаты, как адсорбенты и дополнительный источник йода;

• •    ПИ № 2 – БАД «FUCOID POWER-U», содержащая фукоидан морских бурых водорослей Undaria pinnatifida (мекабу) и Laminaria japonica (комбу) не менее 66%, разработанная компанией HAEWON BIOTECH, INC (Южная Корея);

• •    ПИ № 3 – опытные образцы фукоидана бурых водорослей, произведенные в лаборатории Даляньского технологического университета.

На втором этапе исследований в производственной и исследовательской лабораториях кафедры «Пищевые и биотехнологии» ФГАОУ ВО «ЮУрГУ» (НИУ) были получены опытные образцы:

Образец 1 – хлеб пшеничный из муки высшего сорта;

Образец 2 – йогуртовые продукты на основе восстановленного сухого молока и заквасок прямого внесения LYOBACYOYO ( Streptoсoссus salivarius ssp. Thеrmophilus, Laсtobaсillus del-brueсkii ssp.bulgariсus ).

При формировании рецептур хлеба и кисломолочных продуктов учитывались два аспекта:

• 1)    рекомендуемая доза фукоидана для человека составляет 100 мг в сутки (Т.К. Каленик, Л.Н. Федянина, Е.С. Смертина, 2011) при суточной норме потребления хлеба 325–345 г., а молочных продуктов 500мл;

• 2)    сохранение направленного биологического действия в отношении блокирования оксида-тивного стресса и улучшение потребительских достоинств полученных изделий [3, 6].

Для установления влияния фукоидана на сохраняемость обогащенных хлебобулочных и молочных продуктов в течение гарантированных сроков хранения (по МУК 4.2.1847-04) опытные образцы были заложены на хранение [5]. Условия хранения: для йогуртового продукта при температуре (4 ± 2) °С, для хлеба при температуре (20 ± 2) °С и относительной влажности воздуха не более 85%. Показатели качества йогурта контролировали через каждые 24 часа в течение всего регламентированного срока хранения. Оценку свежести хлеба проводили через 3, 24, 48 и 72 часа после выпечки. Качество контрольных и опытных образцов оценивали по регламентированным для хлебобулочных и кисломолочных продуктов показателям качества.

Для определения АОА фукоиданов был использован электрохимический метод кулонометрического титрования. В основе кулонометрических методов лежит закон Фарадея, устанавливающий связь между массой электропревращенного вещества и количеством затраченного электричества [4]. В своей работе мы использовали универсальный прецизионный кулонометр «Эксперт-006-анти-оксиданты», разработанный и серийно выпускаемый НПК ООО «Эконикс-Эксперт», г. Москва, № 23192–02 в Госреестре СИ РФ средств измерений РФ [1].

Определение АОА пищевого ингредиента осуществляли по следующей методике.

• 1)    Перед началом работы платиновые электроды выдерживали в 96% этаноле 30 мин., затем промывали дистиллированной водой. Рабочую поверхность стеклоуглеродного электрода зачищали механически.

Стандартный раствор аскорбиновой кислоты квалификации x.ч. готовили по точной навеске (0,05–0,1 г) и растворяли в 100 мл 96% этанола.

• 2)    Подготовка образцов фукоидана – навеску 0,1 г образца растворяли в 10 мл дистиллированной воды, нагревали на водяной бане до 50ºС, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Для исследования брали надосадочную жидкость.

• 3)    Электрогенерацию брома осуществляли при постоянной силе тока 50.0 мА или 5.0 мА из водных 0,2 М растворов калия бромистого в 0,1 М растворе серной кислоты. Конечную точку кулонометрического титрования определяли бипотенциометрически с двумя поляризованными игольчатыми платиновыми электродами (ΔЕ = 300 мВ).

В ячейку объемом 50 см3 вводили 25,0 см3 фонового раствора, опускали электроды и включали генераторную цепь. По достижении определенного значения индикаторного тока в ячейку вносили аликвоту жидкого исследуемого образца (0,1 – 1,0 см3). Для титрования брали аликвоты с таким расчетом, чтобы время титрования не превышало 5 мин. Конечную точку титрования фиксировали по достижению первоначального значения индикаторного потенциала.

Массу вещества рассчитывали по формуле:

QM m=    , nF

Где Q – количество электричества, Кл; M – молярная масса вещества, г/моль; n – число электронов, участвующих в реакции; F – постоянная Фарадея (96485,3415 Кл/моль).

Массовую долю влаги в хлебе определяли высушиванием навески изделий при температуре 130 °Cв течение 40 минут; набухаемость мякиша (мл 1 г сухого вещества (СВ), определяли по количеству воды, поглощаемой мякишем хлебобулочных изделий за 5 минут; крошкова-тость, в%, по количеству крошки, образованной за 15 минут при встряхивании навески мякиша при скорости 190–250 оборотов/мин; пористость, в%, по средней массе пяти выемок прибором Журавлева.

Титруемую кислотность для образцов йогуртовых продуктов определяли по стандартным методам, активную кислотность потенциометрическим методом с помощью лабораторного иономераАнион-4101.

Исследования проводились в трехкратной повторности. Достоверность экспериментальных данных оценивали методами математической статистики с помощью приложения MSExcel. Полученные данные приведены с доверительной вероятностью 0,95.

Результаты и обсуждение

Оценка АОА пищевых ингредиентов на основе фукоидана (таблица 2) показала, что суммарная концентрация антиоксидантов изменяется в значительном диапазоне от (43,32 ± 0,2) до (69,17 ± 0,2) аскорбиновой кислоты на 100 г.

Таблица 2.

Показатели АОА пищевых ингредиентов, полученных на основе водорослей (n = 3, Р = 0,95)

Table 2.

Indicators of antioxidant activity of food ingredients derived from algae (n = 3, P = 0,95)

№ п/п	Характеристика образцов функциональных пищевых ингредиентов (ФПИ) Characterization of functional food ingredients	АОА, мг аскорбиновой кислоты на 100 г.
1	БАД «Фуколам-С-сырье» ( Fucus evanescens) , (доля фукоидана 60%), Россия, г. Владивосток	69,17
2	БАД «FUCOID POWER-U»( Undaria pinnatifida, Laminaria japonica) , (доля фукоидана 66%), Южная Корея	59,59
3	Опытный образец фукоидана бурых водорослей, (доля фукоидана 90 ± 10%), КНР	43,32

Различия АОА пищевых ингредиентов, полученных на основе фукоидана, по-види-мому, обусловлены чистотой добавки, а также структурными характеристиками водоросли-сырья. Как известно, альгинаты, входящие в состав БАД «Фуколам-С-сырье» и «FUCOIDPOWER-U», так же способны проявлять антиоксидантные свойства. Альгинаты в условиях invivo способствуют нормализации биохимических показателей прооксидантных и антиоксидантных систем. На модели Fе2 ± аскорбатиндуцированного перекисного окисления липидов мембран гепатоцитов было показано, что перечисленные полисахариды при энтеральном введении животным оказывают антиокислительное действие (Р.Ю. Хотимченко, 2015). Поэтому необходимы дополнительные исследования в части количественного содержания фукоидана в составе ПИ, на которые и будут обращены последующие работы.

В рамках исследования влияния фукоидана, входящего в состав ПИ, на качество и сохраняемость хлебобулочных и кисломолочных продуктов в данной работе применялся ПИ с фукоиданом бурых водорослей – страна производитель Китай (образец № 3), т. к. в соответствии с маркировочными данными он является наиболее чистым.

Образцы хлеба, выпеченные с применением ПИ на основе фукоидана, имели хорошие органолептические характеристики (рисуно к 1) : повышенный объем, развитую тонкостенную пористость, эластичный мякиш, быстро восстанавливающий первоначальную форму. Вкус и запах были выраженными, приятными, указывающими на интенсивное накопление вкусоароматических веществ.

В процессе хранения контрольных и опытных образцов (таблица 3) наибольшие изменения наблюдались в части показателей, характеризующих процессы черствения (потеря влаги, изменение пористости и состояние мякиша).

Рисунок 1. Профилограмма органолептических показателей опытных образцов хлеба с ПИ различной дозировки на основе фукоидана

Figure 1. Profilogram organoleptic properties of experimental samples of bread with different FI dosage based on fucoidan

Таблица 3.

Физико-химические показатели опытных образцов хлеба

Table 3.

Physico-chemical characteristics of experimental samples of bread

Наименование показателя Index	Норма согласно требованиям ГОСТ 31805–2012 Norm	3 часа хранения 3 h storage	24 часа хранения 24 h storage	48 часов хранения 48 h storage	72 часа хранения 72 h storage	Δ, %
Контрольный образец				Control
Влажность мякиша, % | The moisture content of the crumb, %	19,0–48,0	39,9	39,2	37,4	35,1	-12,03
Кислотность мякиша, град. | The acidity of the crumb, grad.	не более 4,0	1,1	1,1	1,1	1,1	–
Пористость мякиша, % | The porosity of the crumb, %	не менее 65	75,9	74,8	73,6	73,0	-3,82
Крошковатость, % | Friability, %	–	5,6	6,0	6,5	7,3	+23,29
Коэффициент набухаемости | The coefficient of swelling	–	6,8	6,8	6,6	6,4	-5,88
Образец хлеба с ПИ на основе фукоидана		The sample of bread with FI on the basis of fucoidan
Влажность мякиша, % | The moisture content of the crumb, %	19,0–48,0	41,9	41,4	40,1	37,4	-10,74
Кислотность мякиша, град. | The acidity of the crumb, grad.	≤4,0	1,0	1,0	1,0	1,0	–
Пористость мякиша, % | The porosity of the crumb, %	≥65	79,7	78,6	77,8	77,8	-2,38
Крошковатость, % | Friability, %	–	3,7	4,1	4,9	5,5	+32,73
Коэффициент набухаемости | The coefficient of swelling	–	8,7	8,6	8,4	8,0	-8,05

Для оценки сохраняемости фукоидана после выпечки, была исследована его термостабильность. Для опыта были взяты образец хлеба с содержанием добавки в количестве 0,2%, от массы муки, так как по органолептическим и физико-химическим показателям качества данный образец имел наилучшие результаты.

Количественное определение остаточного количества фукоидана в хлебе определяли спектрофотометрическим методом в модификации (Z. Dische, А.И. Усов).

Для этого готовили вытяжку из хлеба: 0,2 г образца перемешивали на магнитной мешалке в течение 1 часа при температуре 70 °С с 25 мл 0,1 М НСl. Экстракт отделяли центрифугированием (6000об/мин, 20 мин). Осадок экстрагировали 0,1 M НСl еще раз. Надосадочные жидкости объединяли и диализовали в течение 24 ч против бидистиллированной воды. Диализат в количестве 2,5 мл переносили в колбу объемом 50 мл, доводили до метки бидистиллированной водой. Отбирали аликвоту объемом 0,5 мл, приливали 4 мл раствора серной кислоты (5:2), перемешивали и добавляли 1 мл концентрированной серной кислоты. Полученную смесь перемешивали и нагревали на водяной бане при 70 °С в течение 10 минут. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры и приливали 0,1 мл 3% раствора хлоргидрата L-цистеина. Смесь выдерживали при комнатной температуре 30 минут. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-56 при λ = 396 нм, λ = 430 нм, длина оптического пути 10 мм.

Содержание фукоидана в пересчете на сухое вещество (%) вычисляли по формуле:

Х ф = 5 т 0 ( D 096 - d 4³⁰ ) т ф ( 100 - W ) (2)

где D ³⁹⁶ , D ⁴³⁰ – оптическая плотность испытуемых растворов при длинах волн 396 и 430 нм;

396 430

D _ф , D _ф – оптическая плотность раствора фукоидана при длинах волн 396 и 430нм; m ф – навеска сырья, г; m 0 – навеска фукоидана, г; W – потеря в массе сырья при высушивании, %;

Остаточное содержание фукоидана в готовом изделии составило 0,196 ± 0,0015 мг/г. Полученные данные свидетельствуют о термостабильности фукоидана в составе хлеба, что, в свою очередь, указывает на эффективность внесения данного пищевого ингредиента в состав рецептуры хлеба.

Интересным на наш взгляд является изучение влияния ПИ с фукоиданом на торможение процессов плесневения хлеба. Для оценки ингибирования споровой микрофлоры микромицетов были проведены исследования на основе выдержки образцов хлеба в провокационных условиях (25 ± 1 °С, относительная влажность воздуха 75 ± 5%). При визуализации образцов хлеба с ПИ роста мицелия не наблюдается (рисунок 2) даже на 10 сутки хранения, тогда как в контрольном образце они визуализируются. При микроскопии мицелия идентифицированы плесневые грибы рода Mucor . Данный факт подтверждает сильные бактерицидные свойства фукоиданов, обусловленные высокой АОА.

При исследовании влияния ПИ на основе фукоидана на качество йогуртовых продуктов были получены данные его благоприятного воздействия на весь комплекс потребительских свойств. По окончании процесса ферментирования (рисунок 3) сгустки йогуртовых продуктов с ПИ имели устойчивость, были однородны в отличие от контрольного образца. В опытных образцах после вымешивания не наблюдалось активного отделения сыворотки, вкус и запах были приятными слегка кисловатыми.

• (a)                                                                    (b)

Рисунок 2. Оценка устойчивости опытных образцов хлеба к плесневению (результаты на 10 сутки хранения): (a) контроль; (b) хлеб с ПИ на основе фукоидана

Figure 2. Evaluation of stability samples of bread mold (results in 10 days of storage): (a) control; (b) bread with FI on the basis of fucoidan

(a)

Консистенция достаточно однородная, незначительное отделение сыворотки The consistency is relatively smooth, a slight separation of the serum

• (b)

Сгусток плотный, однородный по всей массе, без отделения сыворотки

Clot dense, homogeneous throughout the mass, noseparation of whey

Рисунок 3. Характеристика сгустков йогуртовых продуктов после ферментации: (a) контроль; (b) йогуртовый продукт с ПИ на основе фукоидана

Figure3. Characteristics of blobs of yoghurt products after fermentation: (a) control; (b) yogurt product with FI on the basis of fucoidan

В процессе хранения йогуртовых продуктов были получены данные, свидетельствующие о том, что использование ПИ на основе фукоидана положительно влияет на сохранение потребительских характеристик в течение длительного срока (рисунок 4). Процесс кислотообразования наиболее интенсивен в первые 24–48 часов хранения, причем через сутки после ферментации образцы с ПИ имели наиболее выраженные характеристики приемлемые для классических йогуртов. Однако на пятые сутки хранения (120 часов) наблюдалось некоторое снижение активности наращивания тируемой кислотности, что возможно обусловлено действием ПИ.

Активная кислотность (pH) Active acidity

Титруемая кислотность, о Т Titratable acidity

Рисунок 4. Физико-химические показатели качества ферментированных сгустков йогуртов при хранении

Figure 4. Physico-chemical quality parameters of the fermented clumps of yogurt during storage

(a)

(b)

Рисунок 5. Характеристика микрофлоры йогуртовых продуктов после 120 часов хранения: (a) контроль; (b) йогуртовый продукт с ПИ

Figure 5. Characterization of microflora of yoghurt products after 120 hours of storage: (a) control; (b) yogurt product with FI

Основной процесс сквашивания в йогуртах обусловлен активностью Streptoсoсоus salivarius ssp. thеrmophilus , которые дают высокую вязкость продукту. Наличие Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus улучшает и ускоряет процесс сквашивания, уменьшая вероятность развития посторонней микрофлоры (рисуно к 5) . Streptococcus thermophilus вырабатывает молочную кислоту, при этом создавая оптимальную рН среды для роста Lactobacillus bulgaricus .