Антитела к ксено- и эндобиотикам у женщин с привычным невынашиванием беременности

структуры и характера метаболизма Вр и стероидных гормонов позволяет предположить и сходство механизмов образования АТ к этим веществам, и возможное их участие в возникновении репродуктивных нарушений.

Целью нашей работы было разработать методику определения АТ к стероидным гормонам и бензо[a]пирену и изучить особенности образования антител к ксено- и эндобио-тикам у женщин с привычным невынашиванием беременности (ПНБ).

Материалы и методы исследования. Материалом исследований послужили образцы сыворотки крови женщин во втором триместре беременности (12-25 недель): 61 женщина с физиологическим течением беременности (контроль) и 81 женщина с ПНБ. Все женщины наблюдались в Кемеровском областном перинатальном центре ДГКБ №5 и в Областной медико-генетической консультации. Изотипический состав АТ к ксенобиотику бензо[а]пирену (Вр) и к эндобиотикам прогестерону (Pg) и эстрадиолу (Es) определяли методом неконкурентного иммуноферментно-го анализа, разработанного в лаборатории иммунобиотехнологии Института экологии человека СО РАН. Иммунологические полисти-рольные планшеты сенсибилизовали растворами коньюгатов Bp, Pg, Es с бычьим сывороточным альбумином (BSA), синтезированных по методике [11], в концентрации 2 мкг/мл при температуре 25°С в течение ночи. Для блокировки свободных мест на пластике в лунки вносили по 250 мкл. блокирующего раствора (натрий-фосфатный буфер PBS, содержащий 0,5% BSA и 0,05% Tween 20) и инкубировали в течение 30 мин. при комнатной температуре. Сыворотки крови разводили на блокирующем растворе: для определения IgA сыворотку разводили 1:20, IgG – 1:100, IgM – 1:50. В лунки вносили пол 100 мкл. сыворотки крови, инкубировали при 37°С на шейкере в течение 1 ч. Затем в лунки вносили по 100 мкл. пероксидазного конъюгата АТ кролика против иммуноглобулинов человека («Dako-Cytomation», Дания), инкубировали при 37°С на шейкере в течение 1 ч. После каждого этапа инкубации планшеты отмывали 4-5 раз PBS, содержащим 0,05% Tween 20 (PBSТ). Регистрацию адсорбированных на планшете антител проводили с помощью субстратного буфера, содержащего тетраметилбензидин (TMB, США) на фотометре (Пикон, Россия) при длине волны 450 нм.

Соотношение уровней АТ ксенобио-тик/эндобиотик вычисляли путем деления оптических плотностей (OD) Bp/Es и Bp/Pg с вычетом фонового связывания сывороток с BSA. Статистическую обработку данных проводили с помощью непараметрического критерия χ2 с поправкой Йетса на непрерывность вариации при уровне значимости p<0,05 и U-критерия Манн-Уитни (p<0,05) [5]. Относительные риски (RR) возникновения репродуктивной патологии рассчитывали по методу [7] с доверительным интервалом (CI) при 95% уровне значимости.

Результаты и обсуждение. В результате проведенного исследования у женщин с ПНБ и с физиологическим течением беременности были выявлены АТ трех классов А, G, M к ксенобиотику Bр и эндобиотикам – стероидным гормонам Es и Pg. Соотношение уровней АТ Bp/Es и Bp/Pg классов А, G, М у женщин с ПНБ было 1,5-2 раза значимо выше, чем в контрольной группе женщин с физиологическим течением беременности (р<0,05) (рис. 1). Нами были выявлены максимально значимые границы значений соотношений уровней АТ ксенобиотик/эндобиотик, по которым женщины с репродуктивной патологией отличались от контрольной группы (p<0,0001). Соотношения IgA-АТ Bp/Es и Bp/Pg≤2 чаще встречались у женщин с физиологическим течением беременности, у женщин с ПНБ чаще встречались соотношения >2 (рис. 2).

У женщин с физиологическим течением беременности чаще встречались соотношения IgG-АТ Bp/Es≤2 и Bp/Pg≤3, при ПНБ – >2 и >3 соответственно. Соотношения IgM-АТ Bp/Es и Bp/Pg≤4 чаще встречались у женщин с физиологическим течением беременности, при ПНБ – >4 (рис. 2). Максимальные значения риска развития ПНБ обнаружены у женщин при соотношении уровней IgA-АТ Bp/Pg>2 и IgG-АТ Bp/Pg>3 (рис. 2). Риск возникновения репродуктивных нарушений возрастает при одновременном обнаружении IgA- и IgG-АТ с высокими соотношениями как Bp/Es, так и Bp/Pg (табл. 1). При данном сочетании риск возникновения ПНБ увеличивается в 16 раз. Максимальная величина риска возникновения репродуктивных нарушений выявлена при высоких значениях соотношений уровней АТ Bp/Es и Bp/Pg всех трех классов иммуноглобулинов (RR=20,8). Это диктует необходимость комплексного анализа данных показателей для ранней диагностики репродуктивных нарушений.

Рис. 1. Соотношение уровней антител классов A, G, M к бензо[a]пирену и к эстрадиолу (Bp/Es) и к прогестерону (Bp/Pg) у женщин исследуемых групп

I 70

I 40

5 10

Ct

IgA            IgG           IgM

Рис. 2. Удельный вес женщин (%) и относительные риски (RR) возникновения ПНБ при высоких значениях соотношений уровней антител классов А, G, M ксенобиотик/эндобиотик

Выводы: на основании результатов проведенного исследования с помощью разработанной нами методики иммуноанализа АТ к ксено- и эндобиотикам можно говорить об иммунохимическом дисбалансе при ПНБ, для которого характерны высокие значения соотношений уровней АТ к химическим канцерогенам (бензо[a]пирену) и к стероидным гормонам (эстрадиолу, прогестерону) у женщин с репродуктивной патологией. При высоких значениях указанных соотношений риск возникновения ПНБ возрастает в 3-20 раз. Показатель соотношения уровней АТ ксенобио-тик/эндобиотик может являться маркером репродуктивной патологии и рекомендуется для ранней лабораторной диагностики привычного невынашивания беременности.

Таблица 1. Относительные риски (RR) привычного невынашивания беременности (ПНБ) при высоких значениях соотношений уровней антител к бензо[а]пирену и эстрадиолу (Bp/Es) и прогестерону (Bp/Pg)