Апоптоз в герминативной ткани семенников при нарушении нервной и эпифизарной регуляции
Автор: Слесарева Елена Васильевна, Слесарев Сергей Михайлович
Журнал: Ульяновский медико-биологический журнал @medbio-ulsu
Рубрика: Фундаментальная биология и медицина
Статья в выпуске: 3, 2013 года.
Бесплатный доступ
У самцов белых крыс с эпифизарной недостаточностью и нарушением периферической иннервации семенников выявлялась экспрессия ферментов, участвующих в апоптозе и репарации ДНК в сперматогенных клетках, – прокаспазы-3 и PARP-1 (p116/25). Определение ферментов осуществлялось в темное (1 ч) и светлое (13 ч) время на протяжении двух суток. Эпифизарная недостаточность привела к значительному росту экспрессии изучаемых ферментов в созревающих половых клетках и исчезновению циркадианного ритма их динамики. Периферическая денервация семенников, не приводя к исчезновению суточной ритмичности экспрессии ферментов, вызвала значительный рост уровня прокаспазы-3 и PARP-1. Выявленные факты свидетельствуют о росте повреждений в структуре ДНК сперматогенных клеток при нарушении некоторых звеньев внегипоталамической регуляции.
Сперматогенез, суточный ритм, апоптоз, эпифизэктомия, денервация семенников, прокаспаза-3
Короткий адрес: https://sciup.org/14112912
IDR: 14112912
Текст научной статьи Апоптоз в герминативной ткани семенников при нарушении нервной и эпифизарной регуляции
Введение. Проблемы охраны репродуктивного здоровья являются приоритетными в отечественной медицине и здравоохранении. Система оказания помощи мужчинам с патологией репродуктивной системы в настоящее время находится в стадии своего становления, что диктует актуальность и востребованность фундаментальных исследований, посвященных этому вопросу. Инфекционновоспалительные процессы, нарушения эндокринной и нервной регуляции функционирования гонад – одни из основных причин мужского бесплодия. Данные факторы могут оказывать повреждающее действие как на органно-тканевом уровне, так и на уровне генома половых клеток.
С развитием представлений об апоптозе как общебиологическом явлении возникает вопрос о его роли в формировании половых клеток и возможных нарушениях течения при нейро-эндокринной патологии. Известно, что нарушение синтеза и секреции фолликулостимулирующего гормона гипофиза и тестостерона приводит к гибели значительной части сперматогоний и сперматоцитов [3, 8]. В то же время и в нормальных условиях процесс пролиферации и дифференцировки по- ловых клеток сопровождается удалением части клеток на каждой стадии созревания сперматозоидов [6]. Нарушения внегипота-ламической регуляции данных процессов остаются на настоящем этапе малоизученными.
Цель исследования. Изучение уровня активности ферментов – индукторов апоптоза в герминативной ткани семенников при нарушении эпифизарной и периферической нервной регуляции.
Материалы и методы. Опыт выполнен на 72 самцах беспородных белых крыс массой 160–200 г. Животные в течение 20 дней адаптировались к 12-часовому режиму освещенности (освещение с 6 до 18 ч). На всем протяжении опыта доступ к пище и воде был свободным. Для изучения активности ферментов – индукторов апоптоза в спермато-генных клетках по истечении адаптационного периода крысы были разделены на три экспериментальные группы: интактные контрольные (n=24); эпифизэктомированные (n=24) и животные после денервации правого семенника. Эпифизэктомия проводилась по оригинальной методике [2]. Все эксперименты, уход и содержание животных осуществлялись в соответствии с Дерективой № 63 от
22.09.2010 г. Президиума и Парламента Европы «О защите животных, используемых для научных исследований» и приказом Минздрава России № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Выживаемость животных после операции эпифизэктомии составила 69 %. Денервацию проводили по методике, предложенной В.В. Невструевой [4], без экстирпации ганглиев чревного сплетения, что позволило сохранить нормальную иннервацию тканей мошонки. Прооперированных животных продолжали содержать при режиме ос-вещенность/темнота, равном 12/12 (освещение с 6 до 18 ч). Животных с неудовлетворительным состоянием, выражающимся в нарушении координации движений, уменьшении веса, нарушениях функций кишечника, появлении воспалительных процессов, в эксперименте в дальнейшем не использовали.
Выведение животных из эксперимента производили под эфирным наркозом на 40–41-й дни после оперативных вмешательств в 1 ч (темное время) и 13 ч (светлое время) в течение двух суток, что обеспечивало исследование активности ферментов на протяжении двух периодов суточного ритма.
Семенники фиксировали в забуференном формалине и по стандартной гистологической методике изготавливали парафиновые поперечные срезы толщиной 5 мкм. Об уровне апоптоза созревающих половых клеток судили по активности ферментов, участвующих в индукции апоптоза (прокаспаза-3) и в посттрансляционной репарации ДНК (поли-аденозин-рибозо-полимераза – PARP-1). Белки-ферменты выявлялись иммуногистохимически на парафиновых срезах в патологоанатомической лаборатории Республиканской клинической больницы г. Казани. Оценку активности ферментов проводили в сперматоцитах на стадии метафазы мейоза и сперматидах 7–8 этапов развития, используя показатель оптической плотности окрашивания ядер (программа денситофотометрии Месоs C-1).
Для микроскопирования применяли микроскоп Axiostar Plus (Carl Zeiss) с увеличением в 1000 раз (окуляр ×10, объектив ×100). Измерения производились с помощью меди- цинской компьютерной видеосистемы, состоящей из микроскопа Axiostar Plus (Carl Zeiss), цифровой фотокамеры Nikon COOLPIX 995, персонального компьютера Рentium IV и программы автоматизированной обработки изображений Месоs C-1. Для всех параметров при статистической обработке вариационных рядов вычислялись значения средней арифметической взвешенной (М), ошибки средней арифметической взвешенной (m). Достоверность различий между показателями оценивалась t-критерием Фишера– Стьюдента. Уровень значимости различий был принят р<0,05.
Результаты и обсуждение. В группе интактных животных было установлено повышение уровня экспрессии прокаспазы-3 как в сперматоцитах, так и в сперматидах в темновую фазу фотопериода (табл. 1). Известно, что при стимуляции ткани каким-либо митогеном ее клетки переходят в состояние повышенной митотической активности, которое сопровождается активацией апоптоза. При сперматогенезе повышение уровня пролиферативных процессов в темновую фазу эксперимента приводит к тому, что уровень содержания ферментов-индукторов апоптоза также повышается в темновую фазу цикла [1]. Помимо концентрации прокаспазы-3 в сперматогенных клетках нами определялась удельная оптическая плотность иммуногистохимического комплекса PARP-1 – первичные АТ (PARP-1) – DAB-chromogen (табл. 1).
Независимо от пути, по которому протекает апоптоз, его конечным итогом является разрушение ДНК с последующей активацией PARP-1 [7]. В целом, у интактных животных динамика активности PARP-1 соответствовала изменениям уровня каспазы-3 в сперматоцитах и сперматидах при спермиации и на этапе мейоза (табл. 1). Также определялись достоверные различия экспрессии данного фермента в темновую и световую фазы в течение двух суток эксперимента, что свидетельствует о циркадианном ритме его активности. Повышение уровня PARP-1, как и рост пролиферативной активности сперматогоний и сперматоцитов, наблюдалось в темное время эксперимента.
Таблица 1
Этап развития половых клеток |
Прокаспаза-3 |
PARP-1 |
||
Светлое время |
Темное время |
Светлое время |
Темное время |
|
Ядра сперматид 7–8 этапов развития |
0,257±0,031* |
0,417±0,037* |
0,399±0,025* |
0,567±0,018* |
Цитоплазма сперматоцитов на этапе мейоза |
0,103±0,022* |
0,290±0,026* |
0,172±0,036* |
0,398±0,029* |
Примечание. * – р < 0,001 при сравнении значений, полученных в светлое и темное время.
Суточная динамика оптической плотности комплексов белок–АТ в сперматогенных клетках интактных белых крыс (M±m), опт. ед.
Таким образом, у интактных животных наблюдался циркадианный ритм физиологической дегенерации части созревающих половых клеток. Выявленный ритм обнаруживал зависимость от свето-темнового цикла.
Несмотря на повышенную митотическую активность сперматогоний, масса семенников после эпифизэктомии не изменилась. По свидетельству Рузен-Ранге, количество возмож-но-образовавшихся сперматозоидов из одной стволовой сперматогонии для данного вида животных всегда постоянно и не зависит от каких-либо регуляторных влияний [5]. Число образующихся сперматозоидов определяется количеством делений стволовой сперматого-нии в процессе дифференцировки. Однако оно всегда ниже, чем можно предположить путем простого умножения. Данное снижение обеспечивается процессами физиологической дегенерации, которым подвергается часть дифференцирующихся половых клеток, благодаря чему в организме достигается биологическое равновесие между процессами пролиферации сперматогоний и выхода зрелых сперматозоидов. Вероятно, после эпифизэк-томии происходит как увеличение пролиферативной активности сперматогоний, так и повышение процента дегенерирующих клеток, что в целом не отражается на массе органа у полиэстричных животных.
С целью подтверждения данного предположения нами исследовался уровень содержания некоторых ферментов (прокаспаза-3, PARP-1) в извитых семенных канальцах, участвующих в процессах апоптоза созревающих половых клеток, у эпифизэктомирован-ных крыс. После удаления эпифиза произошло достоверное повышение уровня данных ферментов с утратой различий экспрессии в темное и светлое время суток (табл. 2).
Данный факт свидетельствует о том, что с ростом пролиферативной активности спер-матогоний после эпифизэктомии увеличивается и количество «поломок» в структуре ДНК, а соответственно, и большее количество созревающих половых клеток удаляется из дальнейшей дифференцировки.
Таблица 2
Суточная динамика оптической плотности комплексов белок–АТ в сперматогенных клетках эпифизэктомированных белых крыс (M±m), опт. ед.
Этап развития сперматогенных клеток |
PARP-1 |
Прокаспаза-3 |
||
Светлое время |
Темное время |
Светлое время |
Темное время |
|
Ядра сперматид 7–8 этапов развития |
0,615±0,027 |
0,603±0,018 |
0,428±0,052 |
0,467±0,071 |
Цитоплазма сперматоцитов на этапе мейоза |
0,384±0,042 |
0,440±0,056 |
0,183±0,031 |
0,243±0,058 |
Эти положения согласуются с общепринятым понятием об апоптозе как фундаментальном биологическом процессе, занимающем ведущее место в поддержании гомеостаза и сохранении клеточного баланса в многоклеточном организме. Хорошо известны свойства одного из гормонов эпифиза – мелатонина как протектора ДНК и сильного антиоксиданта [9]. Вероятно, при отсутствии биоактивных веществ эпифиза и при повышении пролиферативной активности сперматогоний уровень нарушений в структуре ДНК созревающих половых клеток значительно увеличивается, что приводит к активации белков-ферментов, запускающих программу апоптоза.
Изучая уровень активности ферментов – индукторов апоптоза в денервированных семенниках (прокаспаза-3, PARP-1), выявили значительное увеличение уровня их экспрес- сии в данной экспериментальной группе при сохранении тенденции циркадианного ритма экспрессии изучаемых ферментов (табл. 3). Рост экспрессии прокаспазы-3 и PARP-1 после денервации семенника по сравнению с интактными животными составил 1,8–2,0 раза. Сохранялась тенденция различия между дневным и ночным уровнем синтеза как PARP-1 (p116/25), так и прокаспазы-3, т.е. при денервации циркадианный ритм продукции данных белков сохранялся. Таким образом, денервация приводит к росту повреждений ДНК, с чем связано и увеличение активности PARP-1 в сперматоцитах и сперматидах, а также активация каспазозависимого пути апоптоза. Наличие циркадианного ритма пролиферации сперматогоний в денервированных семенниках позволяет сохранить и суточный ритм экспрессии ферментов – индукторов апоптоза.
Таблица 3
Суточная динамика оптической плотности комплексов белок–АТ в сперматогенных клетках денервированных семенников белых крыс (M±m), опт. ед.
Этап развития сперматогенных клеток |
PARP-1 |
Прокаспаза-3 |
||
Светлое время |
Темное время |
Светлое время |
Темное время |
|
Ядра сперматид 7–8 этапов развития |
0,732±0,056 |
0,886±0,041 |
0,521±0,05 |
0,673±0,057 |
Цитоплазма сперматоцитов на этапе мейоза |
0,456±0,038 |
0,553±0,034 |
0,304±0,026* |
0,412±0,021* |
Примечание. * – различия достоверны при сравнении значений в темное и светлое время суток (р<0,05).
Заключение. Таким образом, нарушение некоторых звеньев нейро-эндокринной регуляции процесса созревания мужских половых клеток, а в частности эпифизарная недостаточность и нарушение периферической иннервации, приводит к значительному росту «поломок» в структуре ДНК сперматоцитов и сперматид и активации каспазозависимого пути апоптоза сперматогенных клеток. Эти процессы несомненно сказываются на фертильности организма и снижают его адаптивные возможности.
-
1. Арав В. И. Влияние пептидов эпифиза на суточную динамику пролиферации сперматого-ний белых крыс / В. И. Арав, В. Ф. Сыч, Е. В. Сле-
сарева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2004. – Т. 137, № 6. – С. 678–682.
-
2. Арав В. И . Метод экстирпации эпифиза у белых крыс / В. И. Арав, С. М. Слесарев, Е. В. Слесарева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – № 9. – С. 385–387.
-
3. Бабичев В. Н. Нейроэндокринология репродуктивной системы (состояние физиологических исследований и перспективы их применения в клинической практике) / В. Н. Бабичев // Проблемы эндокринологии. – 1998. – Т. 44, № 1. – С. 3–12.
-
4. Невструева В. В. Субмикроскопическая организация клеток Лейдига в норме и при нарушении механизмов иннервации / В. В. Невструева // Тр. 2-го Моск. мед. ин-та. Сер. Эмбриология и гистология. Вып. 3. – М., 1974. – Т. 15. – С. 161–169.
-
5. Рузен-Ранге Э. Сперматогенез у животных / Э. Рузен-Ранге. – М. : Мир, 1980. – 165 с.
-
6. Bcl-x and Bax regulate mouse primordial germ cell survival and apoptosis during embryogenesis / E. B. Rucker [et al.] // Mol. Endocrinol. – 2000. – Vol. 14, № 7. – P. 1038–1052.
-
7. Dieldrin promotes proteolytic cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase and apoptosis in dopaminergic cells: protective effect of mitochondrial anti-apoptotic protein Bcl-2 / M. Kitazawa [et al.] // Neurotoxicology. – 2004. – Vol. 25, № 4. – Р. 589–598.
-
8. Meachem S. Spermatogonia: stem cells with a great perspective / S. Meachem, V. von Schonfeldt, S. Slatt // Reprod. – 2001. – Vol. 121, № 6. – Р. 825–834.
-
9. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis / M. J. Jou [et al.] // J. Pineal Res. – 2007. – Vol. 43, № 4. – Р. 389–403.
APOPTOSIS OF TESTICULAR GERMINAL TISSUE IN CONDITION DISORDERSOF THE NERVOUS AND EPIPHYSEAL REGYLATIONS
E.V. Slesareva, S.M. Slesarev
Ulyanovsk State University
Список литературы Апоптоз в герминативной ткани семенников при нарушении нервной и эпифизарной регуляции
- Арав В. И. Влияние пептидов эпифиза на суточную динамику пролиферации сперматогоний белых крыс/В. И. Арав, В. Ф. Сыч, Е. В. Сле-сарева//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2004. -Т. 137, № 6. -С. 678-682.
- Арав В. И. Метод экстирпации эпифиза у белых крыс/В. И. Арав, С. М. Слесарев, Е. В. Слесарева//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008. -№ 9. -С. 385-387.
- Бабичев В. Н. Нейроэндокринология репродуктивной системы (состояние физиологических исследований и перспективы их применения в клинической практике)/В. Н. Бабичев//Проблемы эндокринологии. -1998. -Т. 44, № 1. -С. 3-12.
- Невструева В. В. Субмикроскопическая организация клеток Лейдига в норме и при нарушении механизмов иннервации/В. В. Невстру-ева//Тр. 2-го Моск. мед. ин-та. Сер. Эмбриоло-гия и гистология. Вып. 3. -М., 1974. -Т. 15. -С. 161-169.
- Рузен-Ранге Э. Сперматогенез у животных/Э. Рузен-Ранге. -М.: Мир, 1980. -165 с.
- Bcl-x and Bax regulate mouse primordial germ cell survival and apoptosis during embryogenesis/E. B. Rucker [et al.]//Mol. Endocrinol. -2000. -Vol. 14, № 7. -P. 1038-1052.
- Dieldrin promotes proteolytic cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase and apoptosis in dopaminergic cells: protective effect of mitochondrial anti-apoptotic protein Bcl-2/M. Kitazawa [et al.]//Neurotoxicology. -2004. -Vol. 25, № 4. -Р. 589-598.
- Meachem S. Spermatogonia: stem cells with a great perspective/S. Meachem, V. von Schonfeldt, S. Slatt//Reprod. -2001. -Vol. 121, № 6. -Р. 825-834.
- Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis/M. J. Jou [et al.]//J. Pineal Res. -2007. -Vol. 43, № 4. -Р. 389-403.