Апробирование системы детекции целевых групп микроорганизмов для экологического мониторинга пресноводных экосистем

Сложность взаимосвязей в водных микробных сообществах, изменчивость их структуры и ее зависимость от сезонных и физико-химических параметров, растущая антропогенная нагрузка на водоемы, обусловливают необходимость совершенствования системы микробиологического мониторинга пресноводных экосистем [1, 2]. В настоящее время актуальной является задача создания современной методологической основы программы мониторинга, которая позволила бы не только обнаружить в тестируемых объектах патогенных и условно-патогенных бактерий, но и провести комплексную диагностику состояния пресноводных микробных сообществ с целью определения степени потенциальной опасности этой среды для здоровья человека [3, 4].

Известно, что бактерии играют значительную роль в биогеохимических процессах в озерных экосистемах и существенно влияют на кАчество озерных вод, однако доминирующие бактериальные таксоны, активно участвующие в этих превращениях, большей частью остаются не охарактеризованными [5]. Молекулярно-генетические

подходы, используемые для исследования бактериальные таксоны, активно участвующие в этих превращениях, большей частью остаются не охарактеризованными [5]. Молекулярно-генетические подходы, используемые для исследования разнообразия и состава бактериальных сообществ пресноводных экосистем, позволяют выявить численно доминирующие микроорганизмы и охарактеризовать их распространение. Ранее нами было показано, что для количественной оценки состава и структуры пресноводных микробных сообществ основными целевыми группами организмов должны быть протеобактерии, планктомицеты, цианобактерии и цитофаги-флавобактерии [6, 7].

Цель работы – апробация системы детекции целевых групп микроорганизмов в составе микробных сообществ различных пресноводных водоемов для их экологического мониторинга.

Материалы и методы. Отбор проб и первичная пробоподготовка . Для апробации системы отбирали пробы поверхностной воды из пресных водоемов Восточной Сибири и глубинную воду (оз. Байкал) в стерильные емкости объемом 5 л (табл. 1). Для проведения молекулярно-генетических исследований использовали бактериальный материал, сконцентрированный на бактериальном фильтре (диаметр пор 0,22 мкм, объем воды для фильтрации – не менее 1,5 л) и зафиксированный 70% этанолом. Выделение ДНК из чистых культур и бактериального материала, сконцентрированного на фильтре, проводили с помощью коммерческих наборов Bacterial genomic DNA isolation kit

(Axygen, США) и ДНК-сорб Б (ФГУН ЦНИИ эпидемио-логии Роспотребнадзора, Москва) по адаптированным ранее методикам [8]. Для проведения количественных оценок использовали: 1) серию десятикратных разведений клеточной суспензии чистых культур (начальные концентрации клеток составили 3,6×108 КОЕ/мл для Enterococcus sp., 2,3×108 – для Aeromonas sp. и 3,0×108 – для Pseudomonas putida), 2) ДНК фага λ, которую для контроля эффективности выделения ДНК добавляли в концентрациях 2,5, 12,5 или 25 мкг/мл к каждой аликвоте клеточной суспензии.

Таблица 1. Характеристика мест отбора проб и результаты детекции представителей эубактерий (EUB), таксономических групп гаммапротеобактерии (GAM) и цитофаги-флавобактерии (CF), а также количественная оценка Enterococcus sp. (ENT)

Название	Место обора (общее количество проб, шт.)	EUB*	GAM	CF	ENT (КОЕ/мл) среднее ± СО
озеро Байкал, южная котловина, центральная станция
LB-1	25 м (8)	14,48	25,79	32,88	нд**
LB-2	600 м (8)	16,86	24,97	25,69	нд
LB-3	1000 м (8)	18,49	23,00	30,50	нд
LB-4	1200 м (8)	13,67	28,56	28,41	нд
река Ангара, Братское водохранилище
А1	пос. Железнодорожный (3)	13,45	23,11	25,11	0,01±0,005
А2	г. Усолье-Сибирское (3)	12,96	24,06	24,24	0,14±0,035
А3	г. Свирск (3)	12,82	22,17	30,04	0,22±0,061
А4	пос. Балаганск (3)	13,30	24,47	31,61	0,01±0,001
А5	пос. Ключи (3)	15,03	25,06	21,67	2,02±0,085
А6	ст. Подволочная (3)	16,18	24,08	21,99	6,43±0,977
А7	пос. Шумилово (3)	15,15	25,67	24,28	0,23±0,070
А8	ст. Наратай (3)	20,96	28,11	24,18	2,87±1,504
А9	ст. Долоновское расширение (3)	18,13	26,76	34,13	66,29±12,682
А10	плотина БрГЭС (3)	20,94	28,82	30,83	3,56±0,689
пресноводные озе		ра Восточных Саян
S1	оз. Изумрудное (12)	15,86	24,97	25,69	0,19±0,029
S2	оз. Малое Черное (8)	12,63	23,00	30,50	0,36±0,071
S3	оз. Большое Черное (12)	11,83	28,56	28,41	0,36±0,013
S4	оз. Перевальное (4)	12,12	25,99	23,38	1,27±0,143
S5	оз. Тухурен-Нур (4)	10,59	20,52	25,66	0,01±0,006
S7	оз. Аршантай-Нур (20)	14,22	24,43	18,43	0,01±0,005
холодные родники на территории национального па			рка «Алханай», Забайкальский край
Al1	Родник 1 (12)	18,30	28,39	24,55	0,08±0,009
Al2	Родник 2 (12)	17,73	25,73	25,54	0,27±0,020
Al3	Родник 3 (12)	20,94	26,31	28,11	0,07±0,006
Al4	Ручей Сухой Убжогое (8)	18,13	25,71	26,76	0,04±0,003

Примечание: * Для детектируемых групп представлены значения СТ; ** не детектированы

Полимеразная цепная реакция. Структуры праймеров, использованных в работе, приведены в таблице 2 [8, 9]. Детекцию целевых групп микроорганизмов вели в режиме реального времени на амплификаторах Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) и CFX^®-Real Time System C1000 Thermal Cycler (BioRad, США), используя набор iTaq^TM SYBR^® Green Supermix with ROX (BioRad, США) или TaqMan зонды для специи-фической детекции (табл. 2, Биосан, Новосибирск).

Результаты и обсуждение. При проведении микробиологического мониторинга важна не только детекция отдельных санитарно-показательных групп микроорганизмов, но и количественные оценки отдельных видов бактерий или представителей крупных таксонов. Для корректного анализа в этом случае необходимо введение внутренних контролей и калибровочных стандартов. С этой целью проведен эксперимент по использованию ДНК фага λ как внутреннего контроля при выделении суммарных нуклеиновых кислот. Из рис. 1

видно, что эффективность выделения ДНК коммерческим набором с сорбентом выше при невысоких концентрациях бактериального материала. Количественные оценки, проведенные с использованием ПЦР в реальном времени со специфичными зондами для Enterococcus sp. показали, что потери ДНК фага λ при использовании клеточ-ных суспензий с концентрациями бактериальных клее-ток от 10⁷ до 10⁸ КОЕ/мл составляют до 70% и существенно ниже при концентрациях от 10 до 10⁵ КОЕ/мл – не более 20%. Аналогичные результаты были получены при неспецифической детекции ампликонов на групп-специфичных праймерах на эубактерии и гаммапротеобактерии, полученных для культур Aeromonas sp. и Pseudomonas putida . Таким образом, для эффективного выделения суммарных нуклеиновых кислот из природных проб необходимо оценивать численность бактериальных клеток и использовать концентрации, не превышающие 10^5-10⁶ КОЕ/мл.

Таблица 2. Структуры праймеров, использованных в работе

Название праймера	Структура 5’–3’	Целевая филогенетическая группа
консервативные праймеры
EUB500R	TTACCGCGGCTGCTGGFACG	эубактерии
EUB338L	ACTCCTACGGGAGGCAGCAG	эубактерии
специфичные праймеры
GAM395L	CMATGCCGCGTGTGTGAA	гаммапротеобактерии
EUB296L	GAGAGGAAGGTCCCCCAC	цитофаги-бактероиды
EUB412R	CGCTACTTGGCTGGTTCAG	цитофаги-бактероиды
ECST784L	AGAAATTCCAAACGAACTTG	Enterococcus
ENC854R	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Enterococcus
lambda11F	GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG	фаг λ
lambda11R	TTGACACCAGACCAACTGGTAATG	фаг λ
специфичные зонды для ПЦР в реальном времени
EUB375	CCATTGACCAATATTCCTCACTGCTGCCT	цитофаги-бактероиды
EUB975	CCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGC	цитофаги-бактероиды
GPL813TQ	TGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTA	Enterococcus

Рис. 1 . Определение оптимальной концентрации исходной бактериальной суспензии и фаговой ДНК, используемой в качестве внутреннего контроля. Белые кружки – ДНК фага λ 25 мкг/мкл; черные – 12,5 мкг/мкл, серые – 2,5 мкг/мкл

При построении калибровочных кривых необходимо учитывать не только концентрацию выделенной ДНК, но и титр жизнеспособных клеток, который может быть учтен как число колониеобразующих единиц, дающих рост на питательной среде. Поэтому для разработки метода количественных оценок использовали суспензию Enterococcus sp. с известными концентрациями колониеобразующих единиц. График калибровочной кривой для Enterococcus sp., использованный для количественной оценки энтерококков в природных водах представлен на рис. 2, а результаты анализа в таблице 1. Следует отметить, что в поверхностных водах природных пресных водоемов Восточной Сибири в летний период отмечены невысокие концентрации энтерококков, а в глубинных водах озера Байкал в зимний период они не были детектированы с помощью данной диагностической системы.

Учитывая сложные цепи превращений, осуществляемые микроорганизмами в процессе биологического круговорота вещества, любое нарушение среды их обитания может повлечь за собою разрушение отлаженных закономерностей. Именно поэтому важен контроль за жизнедеятельностью микробных сообществ, и особенно тех представителей, которые могут резко изменить экологическую или санитарную обстановку в отдельных природных водоемах. К таким группам относят представителей гамма-протеобактерий и цитофагов-флавобактерий.

Рис. 2. График калибровочной кривой для детекции Enterococcus sp. с помощью специфичного TaqMan зонда. В реакцию использовали следующие концентрации клеток тестируемой культуры 3,6×10⁶, 3,6×10⁵, 3,6×10⁴, 3,6×10³ и 3,6×10² КОЕ/мл

В таблице 1 представлены результаты их детекции в сравнении с детекцией представителей эубактерий в разных природных водоемах. В данной работе для сравнения графиков накопления ампликонов использовали пороговый метод, определяли значение СТ, выраженное в циклах ПЦР, характеризующее каждый график. Сравнивая эти 3. значения, можно судить о начальной концентрации ДНК в исследуемых растворах: чем оно меньше, тем больше анализируемой ДНК в пробе. Следует отметить, что с помощью порогового метода детек-  4.

тированы невысокие концентрации гаммапротео-бактерий и цитофагов-флавобактерий относительно значений для эубактерий во всех пресных озерах. Детекция спектра таксономических групп и сравнительный анализ их значений СТ позволяет 5 характеризовать структуру микробных сообществ   .

и ее изменение в зависимости от физико-химических условий водоемов.                               6.

Выводы: методы детекции микроорганизмов на основе видо- и групп-специфичной полимеразной цепной реакции могут быть использованы для характеристики разнообразия и состава природных микробных сообществ, а применение рутинных аналитических процедур позволяет провести количественные оценки с целью мониторинга их состояния и прогноза его изменений. ^7.

Работа выполнена в рамках ГК № 16.512.11.2130 Министерства образования и науки Российской Федерации.