Арахидонил-липиды мононуклеарных клеток крови как биомаркеры для раннего обнаружения разных опухолей

Введение . Одним из наиболее важных факторов, влияющих на исход рака, является время обнаружения рака, как при первоначальном диагнозе, так и при рецидиве опухоли [1]. В настоящее время большинство случаев рака выявляются относительно поздно, что приводит к высокой смертности.

Основываясь на обнаружении многочисленных биомаркеров рака, предполагалось, что развитие биомаркеров периферической крови хорошо предназначено для улучшения диагностики, управления и лечения злокачественных опухолей [2-4]. Эта так называемая стратегия «основенная на исследовании крови», применима для обнаружения и мониторинга рака с использованием различные клеточные и молекулярные элементы периферической крови (белки, мРНК, циркулирующие опухолевые клетки, метаболиты и др.). Это очень привлекательная стратегия и может способствовать доступным скрининговым программам рака, но часто вытерпивает из-за проблем, возникающих в результате чувствительности и специфичности низких концентра- ций биомаркеров в крови [5], быстрой деградации маркерных молекул in vivo и ex vivo [6], гетерогенности опухолей и сильно варьируемой фоновой экспрессии биомаркеров в незлокачественных тканях [7]. Следовательно, современные диагностические тесты для обнаружение рака довольно недостаточны [8-9], поэтому существует настоятельная необходимость в новых, эффективных неинвазивных молекулярных тестах, основанных на исследования крови, и действующих на ранней стадии заболевания, когда лечебные вмешательства все еще возможны.

В современной науке общепринято, что наиболее жизненно важные функции клеток происходят внутри или вокруг клеточной плазматической мембраны (ПМ), состоящей из белков и липидов. В этом контексте, при воздействии на клетку любого внешнего (физиологического или патогенного) сигнала, в зависимости от его длительности и интенсивности, происходит обратимое либо необратимое, кратковременное или хроническое смещение исходного и установление нового, так называемого изме-

Рисунок 1. Быстрое (5 сек) включение экзогенной [14C]арахидоновой кислоты в фосфолипиды мононуклеарных клеток крови в норме, при раке молочной железы и раке яичников.

Примечание: Здесь и на следующих рисунках данные представлены в процентах от суммы радиоактивности, включенной в мембранные липиды.

На всех рисунках – * – P < 0.5; ** – P < 0.001

Рисунок 2. Пролонгированное (60 мин) межфракционное перераспределение экзогенной [14C]арахидоновой кислоты в фосфолипиды мононуклеарных клеток крови в норме, при раке молочной железы и раке яичников

ненного «метаболического статуса покоя» ПМ. В этих процессах липидный компонент липопротеинового бислоя ПМ участвует быстрыми и обратимыми сдвигами и активными реакциями модификации. Исходя из результатов ранее проведенных нами исследований [10-13], а также данных литературы [14-15], известно, что подобные сдвиги в модификации жирнокислотного (ЖК) состава мембранных липидов выявляются уже с первых секунд действия на клетку внешних сигналов.

Как известно, по своей функциональной значимости в жизнедеятельности клеток особое место занимают липиды, содержащие арахидоновую кислоту (АК), их метаболиты, а также свободная АК.

Согласно имеющимся данным, АК вовлекается в процессы сигнальной трансдукции [16] или стабилизации мембранных структур [17] в качестве регулятора текучести липидного бислоя. Однако, в научной литературе отсутствуют данные о возможных нарушениях в механизмах АК-модификации липидов мембран мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных раком.

МНК состоят из лимфоцитов (включая Т и В-клетки, клетки естественного киллера), моноцитов, макрофагов и дендритных клеток и играют разнообразную и важную роль в мониторинге иммунного гомеостаза, в противоопухолевом ответе, а также в хеморезистентности опухлевых клеток. МНК – как легкодоступный клеточный пул крови, в последнее время используются для изучения механизмов развития рака и для открытия новых, неинвазивных биомаркеров [18-19].

В настоящей работе представлены результаты сравнительных исследований процессов кратковременного (5 сек) включения экзогенной [14C]АК в различные фракции фосфолипидов (ФЛ) и нейтральных липидов (НЛ) и ее относительно более длительного (60 мин) межфракционного перераспределения в ПМ МНК, выделенных из периферической крови практически здоровых доноров и больных раком молочной железы (РМЖ) и яичников (РЯ).

Методы исследования. В работе использованы пробы перифрической крови 10-ти практически здоровых доноров, 14-и первичных больных с РМЖ (стадии Т1N0М0 и Т2N1М0) и 9-и больных с РЯ (стадия Т3NхМ1) по классификации ТNМ. Пробы крови были предоставлены Национальным центром онкологии имени В.Фанарджяна МЗ РА. МНК из цельной крови выделяли методом Иннеса и др. [20] в градиенте фиколл-верографина (1 часть 32.8% верографина и 2.4 части 8% водного раствора фиколла 400 000, d =1.076-1.077). Интактность клеток, определяемая окрашиванием трипановым синим, составляла более 90%. При чрезмерном загрязнении МНК эритроцитами последние лизировали гипотоническим шоком. МНК осаждали при 650g в течение 15 мин и ресуспендировали (106 клеток/мл) в минимальной основной среде Игла (фирмы «Sigma», pH 7.4).

Включение экзогенной [14С]АК в липиды ПМ интактных клеток осуществляли ранее описанным методом [10]. Для этого при 37 оС к клеточной супензии добавляли 0.2 мкКю [14С]АК (сп. акт. 56 мКю/ммоль, «Amersham International», Великобритания), в среде Игла (pH 7.4). На 5 сек и 60 мин инкубации реакции останавливали приливанием холодной смеси хлороформ-метанола (1:2, об/об).

Экстракцию липидов осуществляли по методу Блай и Дайер [21]. Фракционирование ФЛ проводили одномерной ТСХ на на фирменных («Merck», Германия) ТСХ пластинках в системе растворителей хлороформ-ацетон-метанол-уксус-ная кислота-вода (6:8:2:2:1, об/об). НЛ фракционировали в смеси растворителей петролейный эфир-диэтиловый эфирмуравьиная кислота (30:10:1, об/об).

Распределение радиоактивности в идентифицированных соответствующими химически чистыми стандартами («Sigma», США) и проявленных в парах йода липидных фракциях определяли сканированием ТСХ пластинок на радиосканере фирмы «Berthold» (Германия). Степень радиоактивности проб определяли в жидкости Брея на сцинтилляционном спектрометре «Roche-Bioelectronique Kontron», модель SL-4221 (Франция). Статистический анализ проводили согласно методу Стьюдента.

Результаты и обсуждение . Результаты исследования процессов быстрого (5 сек) включения АК в мембранные ФЛ МНК практически здоровых доноров (далее будет отмечен как норма) обнаружили (Рис. 1) преимущественного накопления радиоактивности (более 60% от суммы включенной радиоактивности) во фракции кардиолипинов (КЛ). Во фракции фосфатидных кислот (ФК) относительное содержание радиоактивности составило около 13%, а в остальных фракциях колебалось в пределах 2-5%. Обнаруженный нами факт специфичности КЛ, как предпочитаемого акцептора для быстрых процессов эстерификации АК, дополняют литературные данные о ключевой функциональной значимости в жизнедеятельности клеток ЖК состав КЛ фракции [22-23].

Рисунок 3. Быстрое (5 сек) включение экзогенной [14C]арахидоновой кислоты в нейтральные липиды мононуклеарных клеток крови в норме, при раке молочной железы и раке яичников

Рисунок 4. Пролонгированное (60 мин) межфракционное перераспределение экзогенной [14C]арахидоновой кислоты в нейтральные липиды мононуклеарных клеток крови и в норме, при раке молочной железы и раке яичников

В МНК больных с РМЖ и РЯ в идентичных условиях эксперимента были выявлены (рис. 1), в основном, схожие нарушения в процессах быстрого включения экзогенной АК в исследованные ФЛ фракции. В частности, при двух формах патологии наблюдалось уменьшение относительного содержания КЛ и некоторое повышение всех остальных АК-содержащих ФЛ фракций (лизофосфатидилхолины – ЛФХ, сфингомиелины – СФМ, фосфатидилсерины – ФС и фосфа-тидилинозиты – ФИ и фосфатидные кислоты – ФК). В случае фосфатидилхолинов (ФХ), уровень включенной АК понижена от нормы при РМЖ и РЯ, а во фракции фосфатидилэтано-ламинов (ФЭ) – равномерна норме.

На основании представленных экспериментальных данных, можно заключить, что при РМЖ и РЯ выявленные нарушения АК ацилирования ФЛ на быстрой (5 сек) мембраносвязанной фазе процессов липидных модификации являются характерным признаком для патологических МНК.

Как известно, в быстропротекающих процессах изменения липопротеинового бислоя ПМ участвует, в основном, внутримембранный потенциал модификационных механизмов. В частности, в процессах реконструирования ЖК состава мембранных липидов вовлечен так называемый «цикл Ландса» [24] и включающий ферменты деацилирования (фосфолипазы типа А) и реацилирования (ацилтранс-феразы, трансацилазы) [25-26].

При относительно длительном воздействии внешних факторов, в модификационные процессы липидов вовлекаются также внутриклеточныe кооперативныe механизмы ПМ. Изучение процессов включения и перераспределения АК в мембранные ФЛ в течение 60 мин в норме показало (рис. 2) преимущественное накопление метки (около 45%) в количественно преобладающей во внешнем монослое мембран МНК фракции ФХ. Во фракции КЛ накопление АК составляло около 20%, а в остальных ФЛ фракциях варьировало в пределах 5-10%.

Выявленные закономерности в относительно длительных процессах реацилирования/деацилирования мембранных ФЛ нарушены при РМЖ и РЯ. Так, избирательное накопление ЖК обнаруживаются во фракциях КЛ (до 4050%), а не ФХ (около 15%). В остальных исследованных ФЛ фракциях уровни АК идентифицируются в пределах нормы. На наш взгляд, в процессах как быстрого (5 сек) ацилирования, так и более пролонгированных (60 мин) перераспределения ЖК в мембранных ФЛ выявляются идентичные дефекты в ПМ патологических МНК. Превалирующий субстрат для накопления АК является КЛ при РМЖ и РЯ, что может быть вследствии аналогично активированных ЖК-модифицирующих ферментов – ацилтрансферазов, транс-ацилазов или фосфолипазов.

В следующей серии экспериментов были проведены сравнительные исследования по изучению закономерностей включения АК во фракции моноацилглицеринов (МГ), 1,2-диацилглицеринов (1,2-ДАГ) и триацилглицеринов (ТГ) в мембранах нормальных и патологических МНК.

При 5 сек инкубации МНК с экзогенной АК в норме выявило (рис. 3) включение ЖК во фракции МГ, 1,2-ДАГ и ТГ в соотношении 75, 20 и 5%, соответственно. В экспериментальных сериях с патологическими МНК обнаруживалось достоверное понижение АК во фракции МГ (при РМЖ 25%, при РЯ 45%) и повышение во фракции ТГ (при РМЖ 50%, при РЯ 30%, соответственно) по сравнению с нормой.

При этом уровень АК во фракции 1,2-ДАГ практически остается в пределах нормы. Следовательно, по сравнению с нормой при исследованных двух формах рака обнаруживаются схожие нарушения в механизмах быстрого включения АК во фракции НЛ МНК. Эти сдвиги, вероятно, обусловлены повышением активности ферментных систем межфракционного перераспределения АК по схеме МГ → ДАГ → ТГ, приводящих к быстрому накоплению метки во фракции ТГ, которые выполняют функцию «временного депо» [27] для избытка свободной АК.

Аналогичное исследование в условиях 60 мин инкубации в норме обнаружило (рис. 4) накопление АК во фракции ТГ (около 70%), 1,2-ДАГ (почти 20%) и МГ (10%). Характерно, что при РМЖ и РЯ по сравнению с нормой достоверно подавлялось пролонгированная эстирификация АК во фракции ТГ (50 и 30%, соответственно) на фоне многократного повышения уровня АК в МГ (25 и 45%, соответственно). В этом случае, как и при быстрых процессах ацилирования НЛ, уровни ДАГ оставались в пределах нормы. Эти результаты указывают на торможение при исследованных неоплазиях МГ → ДАГ → ТГ путей пролонгированных фракционных взаимопревращений, активированных при быстрых (5 сек) процессах ацилирования НЛ.

Обобщая вышеприведенные экспериментальные данные, можно заключить, что по сравнению с нормой в липидном бислое ПМ МНК периферической крови больных РМЖ и РЯ преобладают патологические изменения метаболического статуса покоя. В частности, МНК больных характеризуются наличием «дефектных» звеньев в механизмах АК-модификации отдельных фракций как ФЛ, так и НЛ. Некоторые значительно измененные фракции ФЛ (ФХ и КЛ)

и НЛ (МГ, ТГ), в PM МНК могут быть использованы в качестве перспективных биомаркеров, для раннего выявления и оценки злокачественности. Следует отметить, что необходимы дальнейшие исследования для выяснения корреляции между уровнями дефектных липидов и ферментами липидного метаболизма в патогенезе РМЖ и РЯ.