Артефакты форменных элементов и плазмы крови птиц, их происхождение и диагностическое значение

Исследователь, проводя изучение приспособительного процесса индивидуума к факторам среды жизнедеятельности, должен следовать холистическому принципу, то есть изучать реакции с позиции целостного организма. А значит, учитывать взаимодействия и взаимовлияния компонентов систем функций в организме [1, 2].

В этом ключе, необходимо понимать то, что конкретный видовой организм на воздействия окружающей среды отвечает теми морфофизиологическими и биохимическими ресурсами, которыми обладает здесь и сейчас, в независимости от геномного потенциала [1]. При этом ответ организма будет не специфичным и в случае неспецифических адаптационных реакций, и в случае реагирования при развитии той или иной патологии [2]. Примером здесь является система общего адаптационного синдрома с совокупностью этапов стресс-реакции [2]. Механизм специфического иммунного ответа будет вторичным по отношению к первичным базовым и эволюционно рано сформированным механизмам резистентности [1, 2].

В связи с выше обозначенным, важно чётко дифференцировать модификации форменных элементов крови, регистрируемые in vitro вследствие приспособления [3], клинические симптомы патологий [4, 12, 15] и в результате факторов приготовления мазка

[7, 12, 14].

Известно, что антикоагулянты – этилендиаминтетрауксусная      кислота

(ЭДТА) в меньшей мере [7, 12, 14], а цитрат натрия [7, 14] и гепарин [4, 7] существенно в большей степени при хранении с ними образцов крови более двух часов при комнатной температуре (+20 – (+25) 0С) вызывают    изменения    цитоплазмы, мембраны и ядра, осаждение белков плазмы крови, имитирующие симптомы пойкилоцитоза      эритроцитов      и патологических форм лейкоцитов в мазках периферической крови. В этом случае часто регистрируют псевдоэхиноцитоз [4, 7, 12, 13, 15], они же «клетки заусенцев» [7, 12], встречается псевдостоматоцитоз [4, 13, 15], псевдодакриоцитоз [15], псевдошистоцитоз [15], псевдоакантоцитоз [4]. Регистрируют эритроциты с так называемыми «укушенными» краями (по R.V. Pierre (2002)  [15]), то есть, с выемками плазмолеммы, А.И. Воробьёв обозначает данные изменения:   эритроциты с

«фестончатыми»                краями

При хранении образцов крови с антикоагулянтами более двух часов, может происходить с различной интенсивностью цитоплазматическая вакуолизация нейтрофилов и других гранулоцитов крови [4, 7, 12, 14].

Вместе с тем, обнаруживают псевдотоксические изменения лейкоцитов с множественными гранулами – продуктами артефактной коагуляции плазмы крови, которые адгезируются на поверхности лейкоцитов [4]. Данные артефакты могут имитировать симптомы вирусных и бактериальных инфекций [4]. При которых отмечают базофильно- и оксифильно- окрашенную токсигенную зернистость в грунулоцитах, в основном, в нейтрофилах, и агранулоцитах – встречается в лимфоцитах и моноцитах [4].

Необходимо обозначить механизмы образования артефактов клеток и плазмы крови in vitro.

Так, ЭДТА может вызывать повреждение мембран эритроцитов и лейкоцитов, сокращение эритроцитов из-за гипертонуса цитоплазмы с повышенной ионной концентрацией [12]. Дефекты, связанные с длительным (несколько часов) хранением форменных элементов в антикоагулянте (ЭДТА, цитрат натрия) могут варьироваться от зубчатости, шиповатости мембраны эритроцита до изменения плотности окрашивания [14].

Отмечается, что артефактные эхиноциты и стоматоциты могут формироваться вследствие химической и цитохимической реакции in vitro. В частности, высокий pH (щелочная среда) образующийся при реагировании плазмы с избыточно щелочным стеклом пробирки или предметного стекла вызывает псевдоэхиноцитоз [4, 15] и псевдоакантоцитоз [4, 15]. И наоборот, низкий pH (кислая среда), который аналогично, может быть индуцированным от примесей стекла, приводит к псевдостоматоцитозу [4, 15].

Интересны наблюдения авторов [15], так, псевдостоматоциты, равно, как и псевдоэхиноциты возвращаются к нормальной конфигурации эритроцитов in vitro при помещении их в плазму с физиологическим pH среды.

Стоматоциты также могут образовываться при воздействии на эритроциты различных химических веществ, обычно катионных, амфифильных веществ и лекарственных препаратов, например, фенотиазина и хлорпромазина [15].

Вследствие длительного, или напротив, быстрого высыхания мазков, могут образовываться артефакты, имитирующие различные формы пойкилоцитоза, в том числе эхиноциты, акантоциты, стоматоциты [13, 15].

По данным B.I. Dalal et M.L. Brigden [4], аутоантитела IgG могут вызывать агглютинацию клеток крови в присутствии ЭДТА, но не в цитратной крови.

Тогда как аутоантитела IgM часто не зависят от ЭДТА, поэтому агглютинация также наблюдается с другими антикоагулянтами. Здесь интересно то, что некоторые аутоантитела относятся к холодно-реактивному типу, т.е. активны только при комнатной температуре [4].

Весьма малочисленны литературные данные по артефактам клеток и плазмы крови птиц, представлены в основном, в зарубежных публикациях [5, 6, 8, 9], несмотря на то, что эритроциты птиц (Aves L.) более хрупкие и чувствительны к различным воздействиям в сравнении с млекопитающими (Mammalia L.).

Тем более, учитывая и то обстоятельство что кровь молодых птиц весьма сложна в диагностике, отличается обилием сенситивных незрелых форм эритроцитов [6, 8, 10] и лейкоцитов [6, 8, 11].

Целью работы явилось изучение литературных данных (гуманной и ветеринарной медицины) и практический анализ на предмет артефактов форменных элементов и плазмы в мазках периферической крови птиц в модели бройлерных кур раннего постнатального онтогенеза.

Материал и методы исследований. Работа выполнена в соответствии принципам гуманного обращения с подопытными животными, отмеченных в директивах Европейского Парламента и

Совета ЕС по охране животных, используемых в научных целях (Директива 2010/63/EU). Экспериментальная часть работы выполнена на ООО «Чебаркульская птица» (Чебаркульский р-н, Челябинская обл.). Объектом исследования служили бройлерные цыплята Gallus gallus L. кросса Hubbard ISA F15 промышленного стада, из которых в цехе выращивания (клеточное содержание), согласно принципам случайной выборки и сбалансированных групп, сформировали четыре группы (n = 40).

Возраст цыплят в каждой из групп составил 1, 7, 23 и 42 дня постнатального онтогенеза. Экспериментальные группы кур Gallus gallus L. по Anamnesis vitae клинически (status praesens) соответствовали: fusce sanitas status статусу здоровых животных. Кормление и содержание цыплят осуществляли в соответствии с зоогигиеническими нормами согласно рекомендациям (Руководство Hubbard ISA, URL: http://hubbardbreeders.com). Материалом исследований служила цельная кровь, которую собирали в стандартизированные вакуумные пробирки с ЭДТА путём декапитации птицы в 1- и 7-суточном возрасте и прижизненно – пункцией подкрыльцовой вены у 23- и 42- суточных цыплят [10, 11]. Окраску мазков периферической крови производили по Паппенгейму (А. Pappenheim) [10, 11]. Цветные высокого разрешения микрофотографии получали с помощью большого биологического микроскопа («МББ - 1А», «ЛОМО», Россия), оснащенного микрографической окулярной видеокамерой с матрицей разрешением 5 мегапикселей (Full HD High resolution “HAYEAR” CMOS 5.0 Megapixel microscope video camera, КНР) с визуализацией в программе ToupView (ToupTek Photonics, КНР, URL: http://www.touptek.com/) [10, 11], c построенной светодиодной системой освещения микропрепаратов белым спектром (реализован принцип Кёлера (A. Köhler) [10, 11]. Для наиболее качественного изображения клеток крови, применяли 90-кратный апохроматический объектив масляной иммерсии с апертурой 1,3 («ЛОМО», Россия), позволяющий получать      микрофотографии      со специальной коррекцией хроматических аберраций. Калибровку видеокамеры производили по шкале объект-микрометра для проходящего света с ценой деления 0,01 мм («ОМП» ГОСТ 7513-55 «ЛОМО», Россия) в программе ToupView. В программе ToupView определяли масштаб изображений и на микрофотографиях размещали масштабную линейку с ценой деления в 10 микрометров (μm). На предмет изучения артефактов клеток и плазмы, был выполнен    анализ    158    (n=158)

микрофотографий полей зрения в мазках периферической крови.

Результат исследований. Были идентифицированы          различного морфологического характера единичные артефакты эритроцитов, лейкоцитов и плазмы периферической крови (Рисунок 1, 2). А.И. Воробьёв, подчёркивает (https://www.youtube.com/watch?v=Dor_ XUuTW2s), в мазке крови, в норме, могут в небольшом количестве встречаться эритроциты с фестончатыми краями (Рисунок 1: 1.2), это обычно нормальные артефакты вследствие приготовления мазка,     то     есть,     механическом растаскивании ткани крови по поверхности стекла (https://www.youtube.com/watch?v=Dor_ XUuTW2s).         Авторы         [7;

https://eclinpath.com/atlas/hematology/blood-artifacts/ ] регистрировали вакуоли в цитоплазме эритроцитов. Представлены вакуольные артефакты в эритроцитах птиц, при этом, более мелкие вакуоли сравнительно многочисленны в отдельных эритроцитах (Рисунок 1: 1.1, 1.3), а крупные вакуоли единичны (Рисунок 1:  1.4).

J.W. Harvey отмечает, в процессе высушивания мазков крови, в эритроцитах могут    образовываться    артефакты, оптически визуализируемые в виде просвечивающихся лакун овальной, округлой или неправильной формы [9, p. 20], эти артефакты, ввиду оптического светопреломления выглядят полосчатыми зелёно-желтыми образованиями (см. рис.1: 1.3, 1.2).

Рисунок 1 – Артефакты форменных элементов и плазмы крови птиц Gallus gallus L., окраска мазков по Паппенгейму, здесь и далее, в скобках указан возраст птиц. Вакуоли в цитоплазме эритроцитов: 1,1 (1-е сут.) – показаны черными стрелками, в центре полихроматофильный эритроцит; 1,3 (23-е сут.) – показаны белыми стрелками, в центре митотический базофильный эритробласт; 1,4 (1-е сут.) – показана белой стрелкой; фестончатые («укушенные») края эритроцитов: 1,2 (23-е сут.) – показаны черными стрелками, в центре сегментоядерный гетерофил; опалесцирующие лакуны в цитоплазме эритроцитов: 1.3 – показаны черными стрелками, 1,2 – показаны белыми стрелками; околоклеточная коагулированная зернистость плазмы: 1,4 (1-е сут.) – показаны черными стрелками. Здесь и далее, цена деления масштабной линейки десять микрометров (10 µm)

Аналогичной природы артефакты T.W. Campbell называет перинуклеарными кольцами [6, p. 40]. Данные образования в эритроцитах автор объясняет особенностью коагуляции стромы эритроцитов в ходе медленного высушивания мазков или воздействия химических фиксаторов, в частности паров формалина [6, p. 40]. P. Clark et al. показывают артефакты в цитоплазме зрелых эритроцитов зеленого карликового гуся (Nettapus pulchellus) в виде рефракционных пятен от красителя, возникающие вследствие недостаточного высыхания клеток перед окрашиванием [8, p. 19, 22].

Подобные артефакты в незначительном количестве неизбежны в практической работе. В помещении возможны колебания температурного и влажностного режимов, к тому же, учитывая физиологическую, сравнительно с млекопитающими животными, высокую температуру тела птиц, эритроциты в ходе приготовления мазка подвергаются существенному температурному шоку, и вследствие этого, могут формироваться подобные изменения.

Рисунок 2 – Артефакты плазмы крови птиц Gallus gallus L., окраска мазков по Паппенгейму. Околоклеточная коагулированная зернистость плазмы: 2,1, 2,2 (1-е сут., в центре сегментоядерный гетерофил и базофил соответственно); 2,3, 2,4 (42-е сут., справа и в центре соответственно – моноцит) – показаны черными стрелками; адгезированная коагулированная зернистость плазмы на поверхности клеток: 2,3, 2,4 – показаны белыми стрелками

T.W. Campbell [5] отмечает возможное наличие мелкой зернистости вокруг форменных элементов в мазках крови (см. Рисунок 1: 1,4; Рисунок 2), по мнению автора, это является нормальным артефактом – особенностью коагуляции плазмы крови при фиксации мазка [5, p. 182, 183, p. 194]. При этом нередко, подобная зернистость плазмы крови может окрашиваться (см. Рисунок 1: 1,4; Рисунок 2) и в случае адгезии её на лейкоцитах – имитировать токсические формы гранулоцитов и агранулоцитов (Рисунок 2: 2,3, 2,4).

Заключение. Единичные морфологические изменения клеток и плазмы в мазках периферической крови являются нормальными артефактами полиэтиологичной природы.

Однако, важно дифференцировать артефакты форменных элементов и плазмы от модификаций адаптационного характера и изменений клеток крови, являющихся симптомами инфекционных, инвазионных и незаразных патологий.

Резюме

Работа посвящена изучению литературных данных (гуманной и ветеринарной медицины) и практическому анализу артефактов форменных элементов и плазмы в мазках периферической крови птиц в модели бройлерных кур Gallus gallus L. раннего постнатального онтогенеза. Возраст исследуемых клинически здоровых цыплят и молодых кур составил: 1 – сутки, 7-е сутки, 23-е сутки и 42 сутки (n=40). Было изучено 158 (n=158) цветных с высоким разрешением микрофотографий полей зрения, в мазках крови окрашенных по Паппенгейму. В результате этого были идентифицированы единичные артефакты эритроцитов птиц: цитоплазматические вакуоли различного характера, фестончатые «укушенные» края клеток. Обнаружены артефакты плазмы крови: околоклеточная и адгезированная на поверхности клеток окрашенная коагулированная зернистость. В некоторых случаях, данная зернистость имитировала токсические формы гранулоцитов и агранулоцитов периферической крови птиц. Необходимо отличать артефакты клеток и плазмы в мазках периферической крови от адаптационных изменений и симптомов инфекционных, инвазионных и незаразных болезней.