Гидролиз крахмала термои РН-стабильной глюкоамилазой при изменении физико-химических факторов

Важными факторами, влияющими на скорость ферментативной реакции, являются концентрация субстрата и фермента, температура и рН-среды.

Особенности протекания реакции гидролиза при использовании мезофильных ферментов для гидролиза крахмала отражены в литературных источниках [1].

Однако отсутствуют данные о гидролизе крахмала термо- и рН-стабильными глюкоамилазами, полученными из термотолератных штаммов рода Rhizopus и Aspergillus .

Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей изменения скоростей ферментативных реакций в зависимости от различных температур, величин рН среды при образовании и распаде фермент-субстратного комплекса.

Объектами исследования были термостабильные глюкоамилазы (ГлА), полученные из термотолерантных штаммов: R. Pygmaues P1 [2] и Asp. Avamori ВУДТ-2 [4], очищенные по методу [3] с удельной активностью 280 ед./мг белка. Скорость гидролиза крахмала в зависимости от его концентрации определялась при значениях рН 2,5-6,5 и температуре 30-65 оС. Концентрация крахмала изменялась в возрастающем порядке от 2 до 4 %. Высокоочищенные глюкоамилазы вносились в субстрат из расчета 0,4-2,0 ед./100 мг крахмала.

Установлено, что изменение концентрации субстрата в указанных пределах при температуре 30-40 оС и рН 5,0 мало влияют на скорость ферментативной реакции. С повышением температуры скорость реакции, как функция концентрации субстрата, выражается гиперболическими кривыми (рисунок 1) в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен:\

V =

V max

Km

1    +[^ ] где V – скорость реакции при [S];

V max – достигаемая полным насыщением фермента субстратом;

K m – константа Михаэлиса.

Рисунок 1 - Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации крахмала при рН 4,5 и температуре 0С: 1 – 65; 2 – 60; 3 – 55; 4 – 50; 5 – 40; 6 – 30.

K m определяет меру средства ферментов с субстратом: чем больше возможность образования фермент-субстратного комплекса, тем меньше величина K m , которая численно равна концентрации субстрата, при которой V = 0,5 ∙V max [1]. Определение V = f([S]) позволило вычислить K m для ГлА R. Pygmaues P 1 и Asp. Avamori ВУДТ-2 при температуре 60 и 65 ^оС.

Различными авторами предлагаются разные методы определения K m [1]. Если построить график зависимости начальной скорости реакции от концентрации крахмала, то можно определить V max . По этому же графику находится [S] при скорости равной 0,5∙ V max . Однако наибольшая трудоемкость в этом методе связана с определением V max , так как нельзя точно установить предельное значение скорости реакции.

Для определения K m применялся графический метод [1], так как в нем используется линейная форма уравнения для равнобочной гиперболы.

График зависимости обратных величин скорости реакции и концентрации субстрата представляет из себя прямую, и в обратной форме уравнения имеет вид:

• — = — + Km г 1 (2) V V max V max • [ 5 ]

Данное уравнение прямой с наклоном K m / V max дает возможность на оси ординат отсечь отрезок 1/ V max . По этому графику определена величина K m для ГлА (1, 2) микромицетов. Изменение величины K m в зависимости от рН среды и температуры представлено в таблице 1.

Таблица 1

Изменение величины K m в зависимости от рН и температуры

t 0C	pH
	2,5	3,0	3,5	4,0	4,5	5,0	5,5	6,0
60	0,55	0,39	0,30	0,13	0,14	0,17	0,20	0,28
	0,76	0,58	0,41	0,22	0,17	0,18	0,22	0,29
65	2,81	0,88	0,67	0,19	0,20	0,31	0,47	0,92
	3,25	1,05	0,80	0,59	0,48	0,50	0,52	1,10

Числитель – K m ГлА R. Pygmaues P 1

Знаменатель – K m ГлА Asp. Avamori ВУДТ-2.

Из данных таблицы 1 видно, что K m пpи 60 и 65 ^оС для ГлА микромицетов имеет наименьшее значение при рН 4,0-5,0, а для ГлА (2) при рН 4,5-5,5, что указывает на оптимальные условия образования фермент-субстратного комплекса.

Повышение температуры до 67 ^оС приводит к частичной термической инактивации ГлА (1), особенно при низком значении рН, на что указывает величина K m . Изменение K m в зависимости от температуры (Х 1 ) и рН (Х 2 ) для ГлА R. Pygmaues P 1 (у 1 ) и Asp. Avamori ВУДТ-2 (у 2 ) можно описать уравнениями регрессии следующего вида:

у 1 = -15,13 + 0,35Х 1 + 0,56Х 2 -0,055Х 1 Х 2 + 0,32Х 2 ² (3); у 2 + -15,37 + 0,36Х 1 + 0,11Х 2 –

0,0051Х 1 Х 2 + 0,33Х 2 ² (4).

Увеличение концентрации крахмала до 3,5-4,0 % сдвигает температурный оптимум действия ферментов в область более высоких температур (60-65 оС). Особенно это проявляется при рН 4,0-4,5.

Из элементарных математических функций наиболее удобной и близкой к экспериментальным кривым (рисунок 1) является экспонента с соответствующим показателем степени. Поэтому кривые зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации крахмала можно представить в виде:

V = Vmax - ( t ) [1 - e - ^{Km (} p H, ^t ) [ S ^]] (5)

Как видно из рисунка 1 максимальная скорость (Vmax), достигаемая полным насыще- нием ф ермента субстратом, является функцией Vmax = f(to), график которой можно аппроксимировать прямой линией:

V max = a + ʙt^o               (6)

Коэффициенты уравнения данной закономерности были найдены по методу наименьших квадратов для ГлА R. Pygmaues P 1 :

V max = -7,09t + 0,29

Величина K m , согласно данным таблицы 1 и уравнений (5), (6), определяется в основном природой глюкоамилазы и является функцией рН и температуры. Анализ этих уравнений показал, что математически они описываются одинаково, где имеет место совпадения знаков перед коэффициентами уравнений. Поэтому структуру данных уравнений можно записать в виде:

K m ( pH ,t⁰ ) =- a o + ^a1 t o + ^a 2 ⁽P^H)-

• - a i,2 (t⁰ • pH ) + a_n(pH)² [ s ]

В общем виде уравнение зависимости скорости ферментативной реакции глюкоамилаз исследуемых микромицетов можно представить как:

V = (a + bt) . (1-

• ^{- (-a} o + a l to ^{+ a} 2 ⁽ PH ^{)- a} 1,2 ^(t ° pH) ^{+ a} 11 ( P^H ) 2 [ ^ ] . ⁽⁹⁾

  -e                         ^,                            )

Для R. Pygmaues P 1 такое уравнение имеет вид:

V = ( 7,09 + 0,29t^o ) .

. (1 - exp(-(15,13 + 0,35t^o + 0,56(pH)-      (10)

• -    0,055(t^o . pH ) + 0,32(pH)² [ S ] ))

Таким образом, кинетика гидролиза крахмала под действием термо- и рН-стабильных глюкоамилаз носит сложный характер, о чем свидетельствует изменение величины K m , которая служит мерой сродства фермента к субстрату.

Можно предположить, что активные центры исследуемых глюкоамилаз и крахмал претерпевают конформационные изменения при рН 4,0-5,0; 4,5-5,5 и температуре 60-65 оС.