Гидролиз крахмала термои РН-стабильной глюкоамилазой при изменении физико-химических факторов
Автор: Григоров В.С., Яковлев А.Н., Яковлева С.Ф.
Журнал: Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий @vestnik-vsuet
Рубрика: Биотехнология, бионанотехнология и технология сахаристых продуктов
Статья в выпуске: 4 (58), 2013 года.
Бесплатный доступ
Изучена закономерность изменения скоростей ферментативных реакций в зависимости от различных температур, величин рН среды при образовании и распаде фермент-субстратного комплекса. Установлено, что кинетика гидролиза крахмала под действием термо- и рН-стабильных глюкоамилаз носит сложный характер, о чем свидетельствует изменение величины K m, которая служит мерой сродства фермента к субстрату, активные центры исследуемых глюкоамилаз и крахмал претерпевают конформационные изменения при рН 4,0-5,0; 4,5-5,5 и температуре 60-65 оС.
Гидролиз крахмала, концентрация субстрата, фермент, температура, рн-среды
Короткий адрес: https://sciup.org/14040126
IDR: 14040126
Текст научной статьи Гидролиз крахмала термои РН-стабильной глюкоамилазой при изменении физико-химических факторов
Важными факторами, влияющими на скорость ферментативной реакции, являются концентрация субстрата и фермента, температура и рН-среды.
Особенности протекания реакции гидролиза при использовании мезофильных ферментов для гидролиза крахмала отражены в литературных источниках [1].
Однако отсутствуют данные о гидролизе крахмала термо- и рН-стабильными глюкоамилазами, полученными из термотолератных штаммов рода Rhizopus и Aspergillus .
Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей изменения скоростей ферментативных реакций в зависимости от различных температур, величин рН среды при образовании и распаде фермент-субстратного комплекса.
Объектами исследования были термостабильные глюкоамилазы (ГлА), полученные из термотолерантных штаммов: R. Pygmaues P1 [2] и Asp. Avamori ВУДТ-2 [4], очищенные по методу [3] с удельной активностью 280 ед./мг белка. Скорость гидролиза крахмала в зависимости от его концентрации определялась при значениях рН 2,5-6,5 и температуре 30-65 оС. Концентрация крахмала изменялась в возрастающем порядке от 2 до 4 %. Высокоочищенные глюкоамилазы вносились в субстрат из расчета 0,4-2,0 ед./100 мг крахмала.
Установлено, что изменение концентрации субстрата в указанных пределах при температуре 30-40 оС и рН 5,0 мало влияют на скорость ферментативной реакции. С повышением температуры скорость реакции, как функция концентрации субстрата, выражается гиперболическими кривыми (рисунок 1) в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен:\
V =
V max
Km
1 +[^ ] где V – скорость реакции при [S];
V max – достигаемая полным насыщением фермента субстратом;
K m – константа Михаэлиса.

Рисунок 1 - Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации крахмала при рН 4,5 и температуре 0С: 1 – 65; 2 – 60; 3 – 55; 4 – 50; 5 – 40; 6 – 30.
K m определяет меру средства ферментов с субстратом: чем больше возможность образования фермент-субстратного комплекса, тем меньше величина K m , которая численно равна концентрации субстрата, при которой V = 0,5 ∙V max [1]. Определение V = f([S]) позволило вычислить K m для ГлА R. Pygmaues P 1 и Asp. Avamori ВУДТ-2 при температуре 60 и 65 оС.
Различными авторами предлагаются разные методы определения K m [1]. Если построить график зависимости начальной скорости реакции от концентрации крахмала, то можно определить V max . По этому же графику находится [S] при скорости равной 0,5∙ V max . Однако наибольшая трудоемкость в этом методе связана с определением V max , так как нельзя точно установить предельное значение скорости реакции.
Для определения K m применялся графический метод [1], так как в нем используется линейная форма уравнения для равнобочной гиперболы.
График зависимости обратных величин скорости реакции и концентрации субстрата представляет из себя прямую, и в обратной форме уравнения имеет вид:
-
— = — + Km г 1 (2) V V max V max • [ 5 ]
Данное уравнение прямой с наклоном K m / V max дает возможность на оси ординат отсечь отрезок 1/ V max . По этому графику определена величина K m для ГлА (1, 2) микромицетов. Изменение величины K m в зависимости от рН среды и температуры представлено в таблице 1.
Таблица 1
Изменение величины K m в зависимости от рН и температуры
t 0C |
pH |
|||||||
2,5 |
3,0 |
3,5 |
4,0 |
4,5 |
5,0 |
5,5 |
6,0 |
|
60 |
0,55 |
0,39 |
0,30 |
0,13 |
0,14 |
0,17 |
0,20 |
0,28 |
0,76 |
0,58 |
0,41 |
0,22 |
0,17 |
0,18 |
0,22 |
0,29 |
|
65 |
2,81 |
0,88 |
0,67 |
0,19 |
0,20 |
0,31 |
0,47 |
0,92 |
3,25 |
1,05 |
0,80 |
0,59 |
0,48 |
0,50 |
0,52 |
1,10 |
Числитель – K m ГлА R. Pygmaues P 1
Знаменатель – K m ГлА Asp. Avamori ВУДТ-2.
Из данных таблицы 1 видно, что K m пpи 60 и 65 оС для ГлА микромицетов имеет наименьшее значение при рН 4,0-5,0, а для ГлА (2) при рН 4,5-5,5, что указывает на оптимальные условия образования фермент-субстратного комплекса.
Повышение температуры до 67 оС приводит к частичной термической инактивации ГлА (1), особенно при низком значении рН, на что указывает величина K m . Изменение K m в зависимости от температуры (Х 1 ) и рН (Х 2 ) для ГлА R. Pygmaues P 1 (у 1 ) и Asp. Avamori ВУДТ-2 (у 2 ) можно описать уравнениями регрессии следующего вида:
у 1 = -15,13 + 0,35Х 1 + 0,56Х 2 -0,055Х 1 Х 2 + 0,32Х 2 2 (3); у 2 + -15,37 + 0,36Х 1 + 0,11Х 2 –
0,0051Х 1 Х 2 + 0,33Х 2 2 (4).
Увеличение концентрации крахмала до 3,5-4,0 % сдвигает температурный оптимум действия ферментов в область более высоких температур (60-65 оС). Особенно это проявляется при рН 4,0-4,5.
Из элементарных математических функций наиболее удобной и близкой к экспериментальным кривым (рисунок 1) является экспонента с соответствующим показателем степени. Поэтому кривые зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации крахмала можно представить в виде:
V = Vmax - ( t ) [1 - e - Km ( p H, t ) [ S ]] (5)
Как видно из рисунка 1 максимальная скорость (Vmax), достигаемая полным насыще- нием ф ермента субстратом, является функцией Vmax = f(to), график которой можно аппроксимировать прямой линией:
V max = a + ʙto (6)
Коэффициенты уравнения данной закономерности были найдены по методу наименьших квадратов для ГлА R. Pygmaues P 1 :
V max = -7,09t + 0,29
Величина K m , согласно данным таблицы 1 и уравнений (5), (6), определяется в основном природой глюкоамилазы и является функцией рН и температуры. Анализ этих уравнений показал, что математически они описываются одинаково, где имеет место совпадения знаков перед коэффициентами уравнений. Поэтому структуру данных уравнений можно записать в виде:
K m ( pH ,t0 ) =- a o + a1 t o + a 2 (PH)-
-
- a i,2 (t0 • pH ) + an(pH)2 [ s ]
В общем виде уравнение зависимости скорости ферментативной реакции глюкоамилаз исследуемых микромицетов можно представить как:
V = (a + bt) . (1-
-
- (-a o + a l to + a 2 ( PH )- a 1,2 (t ° pH) + a 11 ( PH ) 2 [ ^ ] . (9)
-e , )
Для R. Pygmaues P 1 такое уравнение имеет вид:
V = ( 7,09 + 0,29to ) .
. (1 - exp(-(15,13 + 0,35to + 0,56(pH)- (10)
-
- 0,055(to . pH ) + 0,32(pH)2 [ S ] ))
Таким образом, кинетика гидролиза крахмала под действием термо- и рН-стабильных глюкоамилаз носит сложный характер, о чем свидетельствует изменение величины K m , которая служит мерой сродства фермента к субстрату.
Можно предположить, что активные центры исследуемых глюкоамилаз и крахмал претерпевают конформационные изменения при рН 4,0-5,0; 4,5-5,5 и температуре 60-65 оС.