Использование мембранных фильтров при индикации ДНК вируса африканской чумы свиней в комбикорме с помощью ПЦР-РВ

Африканская чума свиней (АЧС) — особо опасное высококонтагиозное заболевание, из-за участившихся вспышек которого вопросы диагностики, механизмов патогенеза, эпизоотический мониторинг требуют постоянного внимания специалистов (1-5). Вирус АЧС, который относится к наиболее опасным и экономически значимым патогенам, передается в основном алиментарно (6, 7). Этот способ подразумевает использование для кормления пищевых и боенских отходов, не подвергнутых термической обработке, которые контаминированы вирусом (6). Кроме того, источником заражения может служить комбикорм, не прошедший ветеринарносанитарную экспертизу и поступающий из районов, неблагополучных по АЧС (8). Перевозка комбикорма в транспортных средствах, не подвергшихся ветеринарно-санитарной обработке, хранение в помещениях, инфицированных возбудителем, также может привести к попаданию в него вируса и, как следствие, к заражению поголовья.

Таким образом, поставка комбикорма, контаминированного вирусом АЧС, в благополучные по инфекции регионы, представляет серьезную угрозу для свиноводческих хозяйств как в промышленном, так и в частном секторе. При анализе комбикормов с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) одно из требований заключается в тщательной очистке образцов от крупных час- тиц и различных химических примесей, которые могут ингибировать реакцию, изменять свойства сорбента и мембранных фильтров на стадии выделения нуклеиновых кислот (НК).

Следует также отметить, что масса образцов комбикорма, поступающих в лабораторию, составляет 3-5 кг, и из-за неравномерного распределения возбудителя в таком большом объеме исследуемого материала существует проблема формирования средней пробы (9). Поэтому возникает необходимость введения дополнительной стадии пробоподготовки при индикации генома вируса АЧС в комбикорме с помощью ПЦР-РВ.

Общая схема пробоподготовки комбикорма была разработана ранее Н.А. Лагуткиным с соавт. (10). Однако эта схема не оптимизирована для конкретного возбудителя (вируса АЧС) и не применялась при исследовании проб комбикорма с помощью ПЦР-РВ.

Наша цель заключалась в разработке методики пробоподготовки с использованием мембранных фильтров для изучения возможности индикации ДНК вируса африканской чумы свиней в искусственно контаминированном комбикорме с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

Методика . В эксперименте использовали комбикорм для свиней, в состав которого входят отруби пшеничные, ячмень 2-го класса, мучка ячменная, мел кормовой, жмых подсолнечный, премикс П55 (КК-55 комбикорм для мясного откорма свиней, «Агрос», Россия). Навески комбикорма (4 шт. по 300 г) контаминировали вируссодержащей кровью (30 см³ на каждую пробу), которую получали от свиньи, экспериментально зараженной вирусом АЧС (штамм Ставрополь 2009). Инфекционный титр в исходном препарате крови составлял 5,0 lg ГАЕ₅₀/см³ (1-я навеска), 2-ю навеску контаминировали разведением вируссодержащего материала с титром 4,0; 3-ю — с титром 3,0 и 4-ю — 2,0 lg ГАЕ₅₀/см³. Комбикорм тщательно перемешивали для равномерного распределения вируссодержащего материала по всей массе.

Для элюции вируса в комбикорм добавляли стерильный физиологический раствор в соотношении 1:5 (масса/объем) и перемешивали в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Для отработки условий концентрирования и очистки вируса использовали 1-ю навеску комбикорма. Суспензию фильтровали через 8 слоев стерильной марли. Затем полученную жидкость разделили на три аликвоты. Аликвоту № 1 однократно замораживали при температуре - 60 ° С. После оттаивания при комнатной температуре пробы осветляли низкоскоростным центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Eppendorf 5804 (Германия). Полученный супернатант пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 450 мкм (ФМНЦ-0,45) («Владисарт», Россия). Для аликвоты № 2 исключали этап замораживания-оттаивания. Пробу центрифугировали при вышеуказанных условиях, полученный супернатант фильтровали. Аликвоту № 3 фильтровали без предварительного замораживания-оттаивания и центрифугирования.

Следующий этап пробоподготовки был одинаковым для всех аликвот: фильтры измельчали в стерильной фарфоровой чашке со стерильным стеклом; добавляли 0,2 см3 деионизированной воды и 1,0 см3 лизирующего буфера, входящего в состав набора для выделения нуклеиновых кислот («Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени», разработка и производство Всероссийского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии) (11). Полученную жидкость отбирали в чистые пробирки объемом 1,5 см3, центрифугировали при 13 400 об/мин в течение 30 с на центрифуге Eppendorf mini spin (Германия). Супернатант использовали для выделения НК.

Остальные навески комбикорма (со 2-й по 4-ю) подвергались всем перечисленным процедурам подготовки: приготовление суспензии, фильтрование через марлю, замораживание-оттаивание, центрифугирование, осаждение на мембранном фильтре, получение супернатанта для дальнейшего выделения НК.

ДНК выделяли по модифицированной методике R. Boom с соавт. (12). Постановку ПЦР-РВ осуществляли в амплификаторе Rotor Gene 6000 («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией по применению тест-системы для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени (11). Учет результатов ПЦР проводили, анализируя кривые накопления флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения используемого амплификатора.

Результаты . Выбор диаметра мембранного фильтра основывался на данных, полученных A. Lucas с соавт. (13) в опытах по фильтрованию крови и сыворотки через фильтры Шамберлана, Беркефельда и Зейтца с разным диаметром пор (300, 450, 500, 1000 мкм). Авторами было установлено наличие вируса в фильтратах при диаметре пор 300 и 450 мкм и его отсутствие в фильтратах при диаметре пор 500 и 1000 мкм (7).

При сравнении различных вариантов подготовки проб с исключением некоторых стадий оказалось, что в этих случаях поры фильтра забивались крупными и вязкими частицами комбикорма (аликвоты № 2 и № 3), что делало невозможным накопление фильтрата для последующего выделения НК и постановки ПЦР-РВ. При сохранении всех этапов (аликвота № 1) был получен фильтрат, который использовали на дальнейших стадиях выявления ДНК вируса АЧС с помощью ПЦР-РВ.

В ПЦР-РВ на матрицах ДНК, выделенных из 1-й (аликвота № 1), 2-й, 3-й и 4-й навески комбикорма, положительный результат регистрировали в 1-3-м образцах (рис.). В пробе № 4, контаминированной кровью с наиболее низким титром вируса (2,0 1дГАЕ₅₀/см³), геном вируса АЧС не обнаружили.

мизированной подготовки проб см. в разделе «Методика»).

График накопления флуоресцентного сигнала при использовании ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для анализа образцов комбикорма, контаминированных инокулятами вируса африканской чумы свиней с разным инфекционным титром: 1 — 1-я навеска (аликвота № 1), 2-4 — соответственно 2-4-я навески, 5 — отрицательный контроль выделения ДНК, 6 — положительный контроль выделения ДНК, 7 — отрицательный контроль ПЦР-РВ,

8 — положительный контроль ПЦР-РВ (подробное описание условий инокуляции и опти

Значения порогового цикла, зарегистрированные при исследовании 1-3-й навесок комбикорма, находились в прямой зависимости от величины инфекционного титра вируса в образцах: для 1-й навески величина Ct была наименьшей и равнялась 19,60, тогда как у 3-й навески достигала максимального значения, равного 25,91 (табл.).

Средние значения порогового цикла (C t ) при использовании ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) для анализа образцов комбикорма, контаминированных инокулятами вируса африканской чумы свиней с разным инфекционным титром ( n = 3)

Примечание. Подробное описание условий инокуляции и оптимизированной подготовки проб см. в разделе «Методика»; н.з. — нет значения Ct.

Таким образом, при исследовании комбикорма на наличие генома вируса африканской чумы свиней (АЧС) с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в диагностическую схему рекомендуется включать стадию подготовки проб, состоящую из приготовления суспензии, фильтрования через марлю, замораживания-оттаивания, низкоскоростного центрифугирования и осаждение на фильтрах с диаметром пор 450 мкм. Проведение полного цикла пробоподготовки комбикорма позволяет получить очищенный от примесей и сконцентрированный материал, который может быть использован для дальнейших исследований на наличие ДНК вируса АЧС с помощью ПЦР-РВ. В подготовленных таким способом образцах ДНК вируса АЧС выявляли при титре от 3,0 lg ГАЕ50/см3.