Эффективность различных методов выращивания вируса африканской чумы свиней в гемопоэтических клетках

На протяжении многих лет в вирусологической практике широко применяют выращивание вирусов в пристеночных культурах клеток с использованием матрасов, аппаратов, роллерных установок и др. Разработаны также методы для выращивания клеток и вирусов в суспензионной культуре в роллерных установках и ферментерах разной производительности с целью лабораторных исследований и получения биопрепаратов (1-6). Преимущество суспензионного культивирования заключается в применении микробиологической техники с ферментерами большого объема, что обеспечивает повышение производительности, экономию питательной среды, возможность осуществлять процесс культивирования в контролируемых условиях за счет поддержания основных технологических параметров в необходимом режиме (7-10). Анализируя специальную литературу, следует отметить, что усилия исследователей направлены на обеспечение максимальной реализации потенциала клеток посредством создания условий их культивирования, приближенным к таковым in vivo (8, 10-12).

По вопросам технологии получения вируса африканской чумы свиней (АЧС) в доступной литературе имеется весьма ограниченное число публикаций, и в частности это касается методов культивирования. Число эффективных клеточных систем невелико, так как практическое применение нашли в основном культуры клеток костного мозга свиней (КМС) и лейкоцитов свиней (ЛС). К тому же часто при получении суспензии клеток КМС из-за непредвиденных обстоятельств приходится использовать кости свиней как источник клеток КМС не сразу, а после разных сроков хранения, для чего требуется изучить вирусрепродуцирующие свойства таких клеток.

Нашей целью была разработка и сравнительная оценка эффективности методов выращивания вируса африканской чумы свиней в различных культурах клеток костного мозга и лейкоцитов свиньи.

Методика . В эксперименте использовали вирус АЧС штамм ФК135, прошедший не более 10 пассажей в культуре клеток костного мозга свиньи (активность 7,00-7,75 lg ГАЕ₅₀/см³).

Суспензию клеток КМС получали от поросят 3-4-месячного возраста с помощью полуавтоматической установки для измельчения костей (изготовитель Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии — ВНИИВВиМ) по разработанной нами методике. Суспензию клеток ЛС готовили предложенным нами способом с применением устройства для выделения плазмы крови свиней. Полученную плазму центрифугировали при 1000 об/мин в течение 20 мин, осадок клеток разбавляли 0,1 % гидролизатом лактальбумина (ГЛА) до рабочей плотности 10⁵ , ^0-6 , ⁰ кл/см³, добавляли 5-10 % свиной сыворотки крови (от общего объема суспензии), а также 7,5 % раствор соды (до рН среды 7,6), антибиотики пенициллин и стрептомицин (по 100 Ед/см³) и канамицин (50 Ед/см³).

Для поддержания культур клеток КМС и ЛС питательной средой служил 0,1 % ГЛА на основе раствора Эрла с добавлением сыворотки крови свиней, 10 % раствора глютамина, 7,5 % раствора бикарбоната натрия (для обеспечения необходимых значений рН), антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, канамицин); использовалась роллерная установка в стандартном режиме («NBS», США).

Выращивание клеток и вируса АЧС проводили в монослойной и суспензионной культуре клеток КМС и ЛС. Культивирование осуществляли различными способами: в 1,5-литровых стеклянных матрасах; в 2литровых бутылях на роллерной установке для монослойно-суспензионного культивирования («NBS», США); в 3-5-литровых бутылях на роллерной установке для суспензионного культивирования (разработана во ВНИИВВиМ); в кассетных аппаратах для стационарного монослойного культивирования (КАСМ), в биологических реакторах (ферментерах) вместимостью 2-5 л («NBS», США).

В процессе выращивания вируса и инкубирования интактной культуры ежесуточно отбирали пробы для определения жизнеспособности и числа клеток, величины рН, инфекционной активности вируса и стерильности (2, 7).

Результаты . Способность репродуцировать вирус АЧС у клеток КМС, полученных после хранения костей. Мы изучили чувствительность к вирусу АЧС у клеток КМС, извлеченных из костей, которые разное время хранились при температуре 4-6 ° С. С указанной целью позвонки поросят массой 25-35 кг освобождали от мягких тканей и помещали в холодильник при 4-6 ° С на 24, 36 и 48 ч, после чего из них готовили клеточные суспензии КМС. Контролем служила суспензия клеток костномозговой ткани, полученная без предварительного хранения костей. Выращивание вируса осуществляли в 2-литровых бутылях в суспензии роллерным методом при следующих условиях: исходная плотность суспензии клеток КМС — 3,0 млн/мл, множественность заражения — 0,1 ГАЕ₅₀/кл., коэффициент заполнения сосудов — 0,33; температура культивирования 37 ° С, величина рН 7,2-7,4; скорость вращения бутылей —

10-12 об/мин, продолжительность культивирования 4 сут.

Установлено, что отмирание интактных клеток в контроле и после хранения биологического материала в течение 24, 36 и 48 ч происходило неодинаково. Сопоставимую жизнеспособность интактных клеток на протяжении всего периода культивирования отмечали в свежеприготовленной суспензии и в образце, полученном после 24 ч хранения костей. В более поздние сроки хранения жизнеспособность клеток снижалась. Вирус накапливался равнозначно в контрольной культуре клеток и в клетках костномозговой ткани, хранившейся в течение 24 ч. При этом титр вируса достигал 7,25-7,50 lg ГАЕ50/см3. При выращивании в клетках, извлеченных из костей после 36- и 48-часового хранения, урожай вируса не превышал соответственно 6,50 и 6,00 lg ГАЕ50/см3.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности накапливать вирус АЧС в клеточной суспензии, полученной из костного мозга свиней после 24 ч хранения костей при температуре 4-6 ° С.

Выращивание вируса АЧС в стационарном аппарате КАСМ и в круговом монослое клеток КМС. Метод выращивания вируса АЧС в монослойной культуре клеток КМС и ЛС считается наиболее простым и доступным (2). Для получения вируса АЧС в субстрат-зависимой культуре клеток чаще всего используют стеклянные и пластиковые матрасы, что позволяет получать вируссодержащий материал в любой лаборатории для исследовательских целей. Как более сложный вариант накопления вируса в стационарном монослое клеток рассматривается применение устройств, оборудования и аппаратов для культивирования, оснащенных множеством пластин, кювет и других твердых субстратов, позволяющих значительно увеличить полезную поверхность культиваторов (2).

В сравнительных опытах мы изучали эффективность применения традиционных методов выращивания вируса АЧС в монослое клеток КМС с использованием 1,5-литровых стеклянных матрасов, вращающихся бутылей и экспериментального аппарата КАСМ, разработанного и изготовленного во ВНИИВВиМ. Этот аппарат выполнен из нержавеющей стали, состоит из металлического сосуда и 12 титановых кювет, которые расположены горизонтально и крепятся на четырех стойках. Аппарат снабжен пробоотборником и устройством для аэрации, выполненными в виде металлических трубок, которые расположены вертикально и соприкасаются с днищем аппарата. На крышке имеются отверстия со штуцерами, соединенными силиконовыми трубками, для загрузки-отгрузки клеточной или вируссодержащей суспензии, подачи воздуха через фильтр для поверхностной аэрации. Аппарат стерилизуют в автоклаве в режиме 2 атм. в течение 2 ч. Загрузку клеточной суспензии осуществляют с помощью сифона, состоящего из 15-литровой бутыли и резиновой пробки с двумя вмонтированными силиконовыми трубками (одна трубка соединяется с пробоотборником, а другая — с фильтром). При загрузке-отгрузке суспензии через фильтр подается сжатый воздух. Производительность аппарата за один цикл составляет 12 л биоматериала.

При сравнении эффективности пристеночных методов культивирования изучали условия выращивания вируса АЧС в стационарной монослойной культуре клеток КМС в аппарате КАСМ, в круговом монослое клеток в 2-литровых бутылях на роллерном аппарате фирмы «NBS» (США) и в 1,5-литровых матрасах (контроль). Плотность посевной суспензии клеток КМС в питательной среде (0,1 % ГЛА на основе раствора Эрла с 10 % свиной сыворотки, рН 7,5-7,6) составляла 2,8-3,0 млн/см3. В 60

суспензию клеток вносили комплекс антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, канамицин) в указанных выше дозах.

Для выращивания вируса клетки предварительно культивировали в аппарате КАСМ в течение 2 сут при следующих условиях: объем заполнения — 12 л; температура 37 ° С, рН 7,2-7,4. Через 2 сут среду меняли (культуральную среду из аппарата отгружали). В свежую среду вносили вирус в объемном соотношении 1:100, тщательно перемешивали и загружали в аппарат 12 л вируссодержащего материала, после чего культивировали в течение 4 сут при 37 ° С (рН 7,2-7,4). В процессе культивирования (на 2-е и 3-и сут) осуществляли периодическую подачу воздуха (2 раза в сутки по 15 мин) с целью аэрации и поддержания рН. По окончании культивирования аппарат перемещали вперед-назад под углом 30-45 ° в течение 2-3 мин для смыва остатка монослоя и отгружали вирусный материал в бутыль с сифоном посредством подачи воздуха через фильтр.

На роллерной установке и в матрасах вирус культивировали в 2-суточной культуре клеток КМС при коэффициенте заполнения бутылей и матрасов 0,16-0,17 и скорости вращения бутылей 12 об/ч. Плотность посевной суспензии — 3,0*10⁶ кл/см³, доза заражения — 0,1 ГАЕ₅₀/кл., рН 7,2-74, температура 37 ° С. Как и в аппарате КАСМ, вирус культивировали в течение 4 сут.

Результаты исследований показали, что динамика накопления вируса в культуре клеток КМС в аппарате и в круговом монослое клеток была одинаковой и конечные титры в обоих случаях достигали в среднем 7,50 lg ГАЕ50/см3, тогда как в матрасах его активность не превышала 7,00 lg ГАЕ50/см3. В то же время производительность аппарата оказалась значительно выше (он заменял соответственно 60 матрасов и 20 роллерных бутылей). Эффективность КАСМ была подтверждена в четырех независимых опытах.

Таким образом, установлено, что аппараты типа КАСМ могут успешно использоваться для выращивания вируса АЧС в клетках КМС в стационарных условиях, обеспечивая более высокую производительность и эффективность в сравнении с матрасами.

Мы также изучили условия выращивания вируса АЧС в круговом монослое клеток КМС и ЛС с использованием роллерной установки и 2литровых сосудов. Опыты показали, что оптимальная плотность посевной клеточной суспензии для ЛС в 2 раза выше, чем для КМС. При этом установлено, что в вариантах с КМС и ЛС вирус в максимальных титрах накапливался при множественности заражения соответственно 0,01-1,00 и 0,0010-0,0001 ГАЕ₅₀/кл. Дву хсуточные клеточные культуры с посевной плотностью 2,8-3,0 млн/мл (КМС) и 5,0-6,0 млн/мл (ЛС) заражали вирусом в объемном соотношении соответственно 1:100 и 1:10000 и инкубировали при 37 ° С, рН 7,2-7,4 и скорости вращения бутылей 12 об/ч в течение 4 сут. Контролем служим вариант, в котором вирус выращивали в этих же клетках в матрасах в аналогичных условиях. Полученные данные свидетельствовали, что в культурах клеток КМС и ЛС, поддерживаемых роллерным способом, инфекционная активность нарастала с одинаковой скоростью и титр вируса достигал 7,50 lg ГАЕ₅₀/см³. В вариантах, когда вирус накапливали в матрасах, его титры были на 0,25-0,50 lg ГАЕ₅₀/см³ ниже, чем при культивировании роллерным способом.

Выращивание вируса АЧС в суспензии клеток КМС и ЛС роллерным методом и в реакторах. Выше отмечалось, что в круговом монослое клеток вирус АЧС накапливался в более высоких титрах, чем в матрасах. Учитывая, что суспензионный метод культивирования характеризуется более высокой производительностью по сравнению с монослойным, мы сравнили эффективности выращивания вируса АЧС глубинным способом в культурах клеток КМС и ЛС с использованием 5-литрового ферментера («NBS», США), роллерной установки для сус-пензионно-монослойного культивирования («NBS», США), а также роллерной установки для суспензионного культивирования (ВНИИВВиМ) и матрасов. Основные технологические параметры при суспензионном роллерном методе были теми же, что при выращивании соответствующих клеток и вируса в круговом (роллерном) монослое. Скорость вращения 3-5-литровых бутылей с суспензионной культурой составляла примерно 12 об/мин. В этом варианте не требовалось предварительного выращивания монослоя клеток, что в 2 раза уменьшало расход питательной среды и на 2 сут сокращало длительность процедуры. Культивирование вируса АЧС в ферментере осуществляли по разработанной нами технологии в течение 4 сут.

Как было установлено, накопление вируса АЧС в клетках КМС и ЛС при роллерном культивировании в суспензии практически не отличалось от такового в варианте с монослоем и титры вируса достигали 7,007,50 lg ГАЕ50/см3. Однако необходимо отметить более высокую экономичность и технологичность роллерного способа получения вирусного материала. Кроме того, активность вируса при выращивании в этих же клетках в матрасах была на 0,25-0,5 lg ГАЕ50/см3 ниже, чем при использовании роллерного метода.

При культивировании в ферментерах вирус АЧС накапливался в суспензии клеток КМС и ЛС до титров 7,50-8,00 lg ГАЕ50/см3, иными словами, реакторный способ обеспечивал более высокие титры, чем остальные сравниваемые в настоящей работе методы.

Итак, вирус африканской чумы свиней (АЧС) накапливался в высоких титрах как в культурах клеток костного мозга свиней, так и в культурах лейкоцитов свиней (7,25-8,00 lg ГАЕ50/см3) при применении кассетного аппарата для стационарного монослойного культивирования, в круговом монослое и в суспензии при роллерном методе, а также при культивировании в биологических реакторах. Следует отметить, что самым эффективным, технологичным и производительным приемом оказалось использование суспензии гемопоэтических клеток в реакторах. По сравнению с выращиванием вируса АЧС в стационарной культуре клеток в матрасах все перечисленные методы более эффективны и могут использоваться для разработки крупномасштабных технологий культивирования этого биоагента.