Подбор затравочных молекул при создании ПЦР-тест-системы для идентификации растительного сырья в продуктах питания

В эпоху научно-технического прогресса, в связи с изменившимися условиями труда и быта, возникла проблема роста числа заболеваний у людей, обусловленных нехваткой биологически активных нутриентов в рационе питания [1].

Одним из наиболее эффективных путей ликвидации дефицита эссенциальных нутриентов в питании человека является обогащение продуктов питания массового потребления биологически активными компонентами природного происхождения. Вследствие чего сегодня все большее внимание уделяется применению растительного сырья (плодов и ягод) в производстве продуктов питания, о чем свидетельствует рост объемов российского рынка продуктов с использованием данного вида сырья.

Интерес к съедобным растениям оправдан. Пищевые растения представляют большую ценность, прежде всего благодаря специфичным сочетаниям биологически и фармакологически активных компонентов. Такие вещества трудно создать искусственно, они хорошо усваиваются человеческим организмом, обладают лечебным и/или профилактическим действием. Благодаря природной гармонии и многообразию входящих в их состав макро- и микронутриентов (углеводы, витамины, минеральные вещества и др.), использование данного вида сырья позволит повысить пищевую и биологическую ценность пищевых продуктов [7].

При производстве пищевой продукции, обогащенной растительным сырьем, необходимо осуществлять жесткий контроль качества и достоверности видовой принадлежности вводимых природных компонентов вследствие распространяющейся фальсификации продуктов питания. По экономическим соображениям наиболее распространенный метод фальсификации – использование более дешевых заменителей ингреди- ентов, входящих в рецептуру продукта питания, имеющих, как правило, пониженную пищевую ценность. Так, например, вместо земляники садовой предлагают клубнику, а вместо персиков – абрикосы.

Решение проблемы обнаружения фальсификаций растительного сырья в продуктах требует соответствующих методов идентификации и имеет первоочередное значение в списке мероприятий, направленных на достижение безопасности и качества реализуемой пищевой продукции. В целях установления фальсификации пищевой продукции идентификация осуществляется путем совокупной оценки физико-химических, органолептических и других показателей [8]. Для этого на практике наиболее широко применяются следующие методы исследования.

Спектральные методы исследования – совокупность методов качественного и количественного определения состава объекта, основанная на изучении спектров взаимодействия материи с излучением. Спектральный анализ используется для определения пектиновых веществ, фенольных соединений, макро- и микроэлементов, содержания тяжелых металлов, степени окисления жиров и др.

Хроматографические методы исследования незаменимы при оценке качества и безопасности пищевых продуктов, имеющих очень сложный химический состав. Например, газожидкостная хроматография (ГЖХ) является наиболее важным методом для изучения состава жирных кислот природных масел и жиров, а также липидов, выделенных из различных продуктов питания. Кроме того, ГЖХ используется при определении содержания жирорастворимых витаминов, синтетических красителей, консервантов, аминокислот, углеводов, ароматических веществ пищевых продуктов, пестицидов и др. [4, 5].

Методы капиллярного электрофореза анализа сложных смесей основаны на использовании элек-трокинетических явлений (электромиграции ионов и других заряженных частиц и электроосмосе) для разделения и определения компонентов. Данный метод позволяет определять аминокислотный состав белков пищевых продуктов, состав органических кислот, содержание фруктозы, глюкозы, сахарозы.

Разработаны и внедрены ферментативные методы анализа . Их применяют при определении лимонной и яблочной кислот для соков; состава моно- и дисахаридов в молочных продуктах питания и плодово-ягодных полуфабрикатах.

Однако используемые в настоящее время методы анализа далеко не всегда позволяют исследовать пищевые продукты достаточно глубоко. Необходимость создания и постоянного усовершенствования специфичных и чувствительных методов, не требующих большого количества материала для анализа и пригодных для рутинной диагностики, неоспорима [5].

Освоение в последние годы методов ДНК-диагностики послужило стимулом для разработки и внедрения в практику высокочувствительных методик оценки качества и экспертизы продуктов питания, основанных на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР) [3]. Полимеразная цепная реакция – это метод амплификации (многократное воспроизведение) in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 раз. В основе метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК по принципу комплементарности [6].

ПЦР-анализ состоит из трех основных процедур: подготовка пробы исследуемого материала, которая в большинстве случаев сводится к изоляции ДНК и ее очистке; амплификация (собственно ПЦР) и детекция продуктов амплификации. Ключевым этапом ПЦР является амплификация – направленная репликация фрагмента ДНК. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов: денатурация ДНК; отжиг праймеров (их присоединение к м-ДНК); элонгация праймеров (синтез). Многократное (циклическое) повторение этих трех стадий приводит к обогащению реакционной смеси молекулами ДНК-мишени, поскольку в каждом новом цикле в качестве матрицы выступает не только исходная, но и вновь синтезированная ДНК.

При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор затравочных молекул или праймеров. Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы [2].

Цель исследования . Подбор затравочных молекул для ПЦР-тест-системы, позволяющей идентифицировать растительное сырье в продуктах питания.

Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования были выбраны клубника и вишня. Для поиска последовательностей генов, к которым необходимо подобрать праймеры, удобно исполь- зовать биоинформационную базу данных NCBI. NCBI (National Centerfor Biotechnological Information, USA) – национальный центр биотехнологической информации, в числе прочего предоставляет сведения о структуре генома живых организмов – о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях. Результаты анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1

Анализ нуклеотидных последовательностей генома клубники и вишни

Наименование сырья	Количество выбранных нуклеотидных последовательностей, присутствующих во всех геномах	Степень сродства по скору, %
Клубника (Fragaria )	69	95
Вишня (Prunussubg. Cerasus)	25	95

Для исследования были использованы следующие сорта клубники: Fragariamoschata; Fragariaorientalis; Fragariavesca; Fragariaxananassa; Fragariavirginianasubsp. Glauca; Fragarianubicola, Fragari-adaltoniana; Fragaria sp.; Fragariachiloensis; Fragarianipponica; Fragariapentaphylla; Fragariamoupinensis; Fragar-ianilgerrensis; Fragariaiinumae; Fragariatibetica; Fragariacorymbosa. При анализе геномов Fragaria выбраны небольшие последовательности, присутствующие во всех геномах. В ходе анализа было выявлено, что общее количество нуклеотидных последовательностей в системе, представленных в Gene Bank, для клубники составило 69, наибольшее сродство по скору – 95 %.

Также проведен анализ геномов Prunussubg. Cerasus, в ходе которого выбраны небольшие последовательности, присутствующие во всех геномах. Анализируя данные, выявили 25 последовательностей для вишни, которые имеют наибольшее сродство по скору (95%).

На следующем этапе исследований в программе Bio Edit было проведено выравнивание и сравнение гомологии нуклеотидных последовательностей клубники и вишни. Результаты представлены на рисунках 1–2.

Рис. 1. Равнение и гомология нуклеотидных последовательностей клубники в программе Bio Edit

Рис. 2. Равнение и гомология нуклеотидных последовательностей вишни в программе Bio Edit

Как показал анализ, все нуклеотидные последовательности клубники и вишни обладают высоким сродством и степенью гомологии 98 %. Выбрали участки последовательностей, идентичные друг к другу, для подбора универсальных праймеров (рис. 3–4).

CGGCTCCTCGCCCCCTCCTCCCGGGAGGCGGACGTCTCGCGCGTCGCGCTCCGGCGCTTCCGCCTGGCCGA CCCTTCCGGGCGTACCGAACACCGGCGTGAATTGCGCCAAGGAACTTGAATGAAAGAGCGTTCCCCCGCCGT CCCGGAGACGGAGACCGCGCGGGTGGTTCGTCGTCTTCAGTATGTCTAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTC GGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGA GTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCGTTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACACGTCGTTGC CCCCCCGACCCCTTCGGGAGCCGGACGGGACGGATGATGGCCTTCCCGTGTGCCCCGTCACGCGGTTGGCA TAAATACCGAGTCCTYGGCGACCGGCGTCGCGGCAATCGGTGGTTGTCAAACCTCGGTGCCTTGTCGCGTGC GTGAGTCGATCGCGGGAC

Рис. 3. Последовательности клубники

AACCTGCCTAGCAGAACGACCCGAGAACTAGTTTCAAAGCGGGGGATGAGGGGTCTTGCGGCTCCTTGTCCCT TTATCTCGGGGGGGTTGCATTGCGTTCGCGCAACCGACCCTTCCTGCGTACAAACGAACACCGGCGCGAATTG CGCCAAGGAACCTGAATGAGAGAGCGCGTCCCCGTTGCACCGGAAACGGTGCGCGCGGGCGGCGTCGTCAT CTTCAAATATGTCAAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGC GATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGG CCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACACGTCGTTGCACCCCCACTACTCCCTCGGGATTGCGGGGTGCGGA TGATGGCCTCCCGTACGCTCCGTCGCGCGGTTGGCATAAATACCAAGTCCTCGGCGACGCACGCCACGACAAT CGGTGGTTGCGAAACCTCGGTTGCCCGTCGTGTGCGGTCGTCGCGCATCGGGGGCTCGAAAAAATGCTTGGC TCCGGCTTGGC

Рис. 4. Последовательности вишни

Разработка праймеров является самым ответственным звеном в ПЦР. Требуется подобрать такой фрагмент молекулы ДНК, который бы отличался генетической консервативностью и присутствовал бы только в исследуемом гене. При этом длина такого фрагмента должна составлять 15–30 нуклеотидов.

К выбранным участкам нуклеотидных последовательностей индивидуально подобрали праймеры, которые исключали бы перекрест при идентификации гена. Первыми выбрали праймеры с параметрами ПЦР для клубники, которые представлены на рисунке 5. Далее выбрали праймеры для идентификации вишни (рис. 6).

А

Нуклеотидный код (IUPAC)

5'-

-3'

Перевёрнутая комплементарная цепь (5' —► 3'): GTC CGC СТС CCG GGA GGA G

5' модификация (если есть)

3' модификация (если есть)

Выберите тип олигонуклеотида | оцДНК [Я

50 нМ Праймер

50 мМ Соли (Na+)

Величина поглощения при 260 нм: 1|

ОП расчитывается только для одноцепочечной ДНК или РНК

| ПОСЧИТАТЬ! | | Поменять цепи | | BLAST2 | | mfold |

Физические константы

Расчёт температуры плавления (Ты)

Длина: |      19|

Молекулярный вес: |               5790.8j (?)

Содержание GC: |         79| %

1 мл раствора с ОП равной |     1| при 260 нм

является |       ~ содержит | олигонуклеотида.

5.329, микромолярным (?) и

30.9| микрограмм(а)

Простой метод (?)

С корректировкой по концентрации солей (?)

|                59| °C

По алгоритму ближайших соседей (?)

Нуклеотидный код (IUPAC)

5'-

-3'

Перевёрнутая комплементарная цепь (5* —► 3'): GCC TTG TCG CGT GCG TGA

5' модификация (если есть)

3' модификация (если есть)

Выберите тип олигонуклеотида | оцДНК |^1

50 нМ

50 мМ

Праймер

Соли(Na+)

Величина поглощения при 260 нм: |1

ОП расчитывается только для одноцепочечной ДНК или РНК

| ПОСЧИТАТЬ! I I Поменять цепи | | BLAST2 | | mfold |

Физические константы

Расчёт температуры плавления (Тм)

Молекулярный вес: |

Содержание GC: |

1 мл раствора с ОП равной [

5478.6 С?)

при 260 нм

|               55| °C

Простой метод (?)

является [ содержит | олигонуклеотида.

5.1 б| микромолярным (?) и

28.з| микрограмм(а)

I              61| °C

С корректировкой по концентрации солей (?)

|               58| °C

По алгоритму ближайших соседей (?)

Б

Рис. 5. Универсальные праймеры для идентификации клубники: А – левый праймер; Б – правый праймер

А

5'-

-3'

Перевёрнутая комплементарная цепь (5‘ —• 3'): TGC CCG TCG TGT GCG GTC GTC GCG СА

5' модификация (если есть)

3‘ модификация (если есть)

Выберите тип олигонуклеотида о^ НК U

50 нМ Праймер        _                       _,_    .

Величина поглощения при 260 нм: 1

50 мМ Соли (Na+) ОП расчитывается только для одноцепочечной ДНК или РНК

| ПОСЧИТАТЬ! | | Поменять цепи | | BIAST2 | | mfold |

Физические константы

Расчёт температуры плавления ( 1м)

Длина:[

Молекулярный вес: [

Содержание GC: Г

1 мл раствора является | содержит |

ОП равной Г

7976.2| (?) 73|^о/о

Т| при 260 нм

I            —69| °C

Простой метод (?)

олигонуклеотида.

3.5Э5| микромолярным (?) и

28.7| микрограмм(а)

I Ё| °C

С корректировкой по концентрации солей (?)

|          —Й] "С

По алгоритму ближайших соседей (?)

Б

Рис. 6. Универсальные праймеры для идентификации вишни: А – левый праймер; Б – правый праймер

Выбранные универсальные непересекающиеся праймеры для определения методом ПЦР растительного сырья (клубники, вишни) представлены в таблице 2.

Универсальные праймеры для тест-системы ПЦР

Таблица 2

Наименование сырья	Длина, п.н.	Праймеры
Клубника	19	CTCCTCCCGGGAGGCGGAC
	18	TCACGCACGCGACAAGGC
Вишня	28	CTCGGGGGGGTTGCATTGCGTTCGCGCA
	26	TGCGCGACGACCGCACACGACGGGCA

Таким образом, проанализированы нуклеотидные последовательности генов растительного сырья (клубники, вишни). С помощью компьютерного моделирования и анализа выбраны универсальные праймеры для идентификации методом ПЦР клубники и вишни.