Ассоциация полиморфных маркеров гена TCF7L2 с сахарным диабетом типа 2

Сахарный диабет (СД) – это группа метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся хронической гипергликемией, которая является результатом нарушения секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов. Хроническая гипергликемия при СД сопровождается повреждением, дисфункцией и недостаточностью различных органов, особенно глаз, почек, нервов, сердца и кровеносных сосудов.

В настоящее время во всех странах мира, особенно в промышленно развитых, наблюдается пандемия СД типа 2, который является одним из наиболее распространенных заболеваний. Он распространён повсеместно, однако уровень заболеваемости в различных регионах мира варьирует в зависимости от многих факторов, в особенности от этнической принадлежности популяции. Сахарный диабет типа 2 встречается в 10 раз чаще, чем сахарный диабет типа 1. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в европейских странах распространённость сахарного диабета 2-го типа составляет 3-6%, в странах Америки: 5% у европеоидов, 10% – у афроамериканцев, 24% – у американцев мексиканского происхождения, у жителей островов Микронезии и Полинезии – до 35%.

В настоящее время ключевыми звеньями патогенеза СД типа 2 считают инсулинорезис-тентность (ИР), нарушение секреции инсулина, повышение продукции глюкозы печенью, а также наследственную предрасположенность и особенности образа жизни и питания, ведущие к ожирению. Роль наследственности в развитии СД типа 2 не вызывает сомнения. Гиподинамия и избыточное питание приводят к развитию ожирения, усугубляя тем самым генетически детерминированную ИР и способствуя реализации генетических дефектов, непосредственно ответственных за развитие СД типа 2.

Для СД типа 2, так же как и для других многофакторных заболеваний, характерна полигения, то есть клинический фенотип является результатом действия нескольких генетических локусов [1]. Различают две основные наследственные причины в формировании гипергликемии – это генетические дефекты β -клеточной функции и генетические дефекты действия инсулина.

К настоящему времени известно около 30 генов, варианты которых предрасполагают к развитию СД типа 2, что подчеркивает поли-генный характер данного заболевания [2, 3]. Генетический вклад можно разделить на два типа: гены, влияющие на развитие инсулиноре-зистентности в периферических тканях (мышцы, печень) и гены, связанные с нарушением развития, роста, пролиферации и функции β-клеток поджелудочной железы.

Недавние исследования в области генетики СД типа 2 выявили несколько предрасполагающих генетических вариантов, которые влияют на функцию и выживание β -клеток поджелудочной железы [4]. Некоторые из них располагались в гене TCF7L2 (ранее известный как TCF4 ), играющего важную роль в развитии и функциональной активности β -клеток.

TCF7L2 расположен в области 10q25.3 и кодирует транскрипционный фактор, который является составной частью Wnt-сигнального пути. С помощью этого сигнального механизма регулируются механизмы роста и развития клеток [5] (рис. 1). Активация этого пути начинается с образования комплекса из белка Wnt, FZD-рецептора и ко-рецептора LRP-5/6.

Это приводит к активации белка Dvl, который фосфорилируется казеинкиназой I ε , после чего ингибирует казеинкиназу 1 и киназу

Рис. 1. Взаимодействие белков в Wnt-сигнальном пути.

Источник: гликогенсинтетазы (GSK3). Это приводит к прекращению деградации β-катенинов, которые проникают внутрь ядра, и связываются с транскрипционным фактором [6].

В гене TCF7L2 было найдено два одиночных нуклеотидных полиморфизма ( rs12255372 и rs7903146 ), показавших сильную ассоциацию с СД типа 2 [7]. Эти данные были подтверждены на множественных этнических исследованиях европейских [8-13], азиатских [14-16], афро-ка-рибской [17] и афро-американской [18] популяциях. Среди всех известных к данному времени генетических маркеров риска СД типа 2, маркеры rs12255372 и rs7903146 показали наиболее выраженную ассоциацию с высоким риском развития СД типа 2 (OR ≥ 1,40) в европейских популяциях [10, 19]. Также была обнаружена ассоциация данных маркеров с повышенным уровнем проинсулина при одновременном сокращении амплитуды инсулинового ответа в ответ на стимуляцию глюкозой [20], низкой секрецией инсулина [21, 22] и уменьшением скорости превращения проинсулина в инсулин [23].

В настоящей работе была поставлена задача изучить ассоциацию полиморфных маркеров rs7903146 и rs12255372 гена TCF7L2 с сахарным диабетом типа 2 у русских больных, проживающих в г. Москве.

Экспериментальная часть

В исследование было включено 440 пациентов с установленным диагнозом СД типа 2 («СД2+») на основании клинических и биохимических исследований. Контрольная группа («СД2-») представляла собой случайную выборку из 264 пациентов без признаков заболевания (табл. 1).

У всех пациентов были измерены следующие параметры: базальная концентрация глюкозы и инсулина в крови, концентрация глюкозы и инсулина в крови через 2 часа после ППГТ (пероральный глюкозо-толерантный тест), а также рассчитаны индексы HOMA-IR (Homeostasis model assessment-insulin resistance) и HOMA- β (homeostasis model assessment of β -cell function), необходимые соответственно для оценки функционирования β -клеток и оценки инсулинорезистентности тканей [24]. Исследуемые группы формировались из числа пациентов Эндокринологического Научного Центра (г. Москва) и Тюменской Государственной Медицинской Академии (г. Тюмень). Выборки были этнически однородны и составлены из русских (по данным анкетирования).

Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [25].

Амплификацию полиморфных участков исследуемых генов проводили с помощью ПЦР «в реальном времени» на термоциклере «ABI StepOnePlus» (Applied Biosystems) в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 16.6 мМ сульфат аммония, 0.01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров, 250 нМ флуоресцентных зондов, 1.5 ед. Taq ДНК-полимеразы (термостабильная ДНК-полимераза Taq производства ЗАО «Евроген», г. Москва, олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген», г. Москва, флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез», г. Москва), 50-100 нг геномной ДНК.

Таблица 1

Сравнительная характеристика больных в группе с установленным диагнозом СД типа 2 (СД2+) и контрольной группе и (СД2-)

Метаболические характеристики	СД2+ (n = 440)	СД2- (n = 264)
Базальный уровень глюкозы (моль/л)	9,9 ± 1,7	5,7 ± 0,5
Уровень глюкозы через 2 часа после ППГТ* (моль/л)	12,4 ± 1,2	6,8 ± 0,7
Базальный уровень инсулина (мЕд/л)	14,8 ± 7,7	10,2 ± 6,2
Уровень инсулина через 2 часа после ППГТ (мЕд/л)	84,0 ± 32,1	48,2 ± 19,9
HOMA-b	46,2 ± 22,4	92,7 ± 46,3
HOMA-IR	6,5±1,6	2,6±0,6

* ПГТТ – пероральный глюкозо-толерантный тест

Условия амплификации фрагментов ДНК: 950C/2 мин – 1-й цикл; 940C/10 сек, 54-660C/60-40 циклов, условия ПЦР, последовательности праймеров, флуоресцентных зондов и метод детекции генотипов для исследо- ванных локусов приведены в табл. 2.

Используемые в зондах флуоресцентные красители – FAM (карбоксифлуоресцеин) и HEX (гексахлорофлуоресцеин), тушитель флуоресценции – BHQ-1.

Таблица 2

Последовательности праймеров, флуоресцентных зондов и особенности амплификации полиморфных участков гена TCF7L2

Ген	Полиморфный маркер	Метод генотипирования	Последовательность праймеров, 5`-3`	Последовательность зондов, 5`-3`	Темпера тура отжига, °С
TCF7L2	rs7903146	TaqMan	ctctgcctcaaaaccta gccttccctgtaactg	agcactttttagatactatataatttaatt agcactttttagatattatataatttaatt	58
	rs12255372	TaqMan	gtccagtttacacataagg cactcagaagagagtcag	caggcaagaatgaccatatt caggcaagaattaccatatt	58

Обозначения полиморфных маркеров даны в соответствии с базой данных dbSNP .

Статистический анализ распределения частот генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат ( χ ²). Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях "случай-контроль"» [26] и пакета статистических программ SPSS версии 17. Достоверными считали различия при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Полиморфные маркеры rs12255372 и rs7903146 представляют собой замены G/T в интроне 4 и С/Т в интроне 3, соответственно. В различных исследованиях была установлена связь изменений в гене с нарушением инсули- нового ответа, секрецией инсулина и уменьшением конверсии проинсулина в инсулин [1922, 27]. Механизм этих изменений в настоящее время до конца не изучен, но, возможно, наличие данных полиморфных маркеров приводит к изменениям в процессе созревания РНК [28]. Нарушение работы β-клеток поджелудочной железы напрямую способствует развитию СД, поэтому было предпринято несколько попыток найти ассоциацию полиморфных маркеров rs12255372 и rs7903146 гена TCF7L2 с данным заболеванием [7-10, 29, 30].

При анализе распределения частот и аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 в группах «СД2+» и «СД2-» были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 3).

Наличие аллеля T и генотипа T/T повышало

Таблица 3

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 в группах «СД2+» и «СД2-»

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Значение /2 Уровень значимости р OR СД2+ СД2- п = 440 п = 264 значение CI95% Аллель С 475 / 0,540 337/0,638 13,11 0,0003 0,66 0,53 - 0,83 Аллель Т 405 / 0,460 191/0,362 1,50 1,21 - 1,88 Генотип С С 141/0,320 103 /0,390 17,34 0,0002 0,74 0,54-1,01 Генотип СТ 193/0,439 131/0,496 0,79 0,58-1,08 Генотип ТТ 106/0,241 30/0,114 2,48 1,60-3,84 риск развития СД типа 2 (OR = 1,50 и 2,48, соответственно). В то же время наличие аллеля С, генотипа С/С уменьшало риск развития этого заболевания (OR = 0,66 и 0,74, соответственно).

При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции β -клеток были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 4).

Для носителей генотипов C/T и T/T в груп- пе «СД2+» и в группе «СД2-», наблюдалось снижение базального уровня инсулина и уровня инсулина через 2 часа после ППТГ, а также увеличение уровня глюкозы через 2 часа после ППТГ и уменьшение индекса HOMA-β.

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs12255372 гена TCF7L2 в группах «СД2+» и «СД2-» статистически достоверных различий найдено не было (табл. 5).

Таблица 4

Анализ ассоциация полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 с метаболическими показателями глюкозотолерантности и функции β -клеток

	«СД2+» (п = 440)				«СД2-»(п = 264)
Метаб. характеристики	С/С	С/Т	Т/Т	Р	С/С	С/Т	Т/Т	Р
Уровень глюкозы через 2 часа после ППГТ(тто1/1)	12,2±1,4	12,9±1,1	13,3±1,3	0,041	6,9±0,3	7,1±0,8	7,5±0,7	0,028
Базальный уровень инсулина (mU/1)	15,1±4,5	14,2±4,7	13,1±3,4	0,043	10,9±5,8	10,4±4,6	ю,о±з,з	0,046
Уровень инсулина через 2 часа после ППГТ (mU/1)	81,7±30,5	79,6±32,3	77,8±34,1	0,028	54,6±20,1	49,2±19,4	45,7±21,1	0,040
НОМА-Ь	52,9±14,5	43,6±21,0	34,9±21,9	0,019	99,2±21,2	94,5±43,1	90,4±43,8	0,021

Таблица 5

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs12255372 гена TCF7L2 в группах «СД2+» и «СД2-»

Аллели и генотипы	Частота аллелей и генотипов		Значение /2	Уровень значимости р	OR
	СД2+	СД2-
	п = 440	п = 264			значение	CI95%
Аллель G	590 / 0,670	372 / 0,705	1,77	0,18	0,85	0,68-1,08
Аллель Т	290 / 0,330	156/0,295			1,17	0,93 -1,48
Генотип GG	190/0,432	122 / 0,462	3,45	0,18	0,88	0,65-1,20
Генотип GT	210/0,477	128/0,485			0,97	0,71 - 1,32
Генотип ТТ	40/0,091	14/0,053			1,79	0,95-3,35

При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции β -клеток были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 6).

В группах «СД2+» и «СД2-» у носителей генотипов GT и TT по сравнению с носителями генотипа GG наблюдались снижение базального уровня инсулина и через 2 часа после ППГТ, повышение уровня глюкозы через 2 часа после

Таблица 6

Анализ ассоциация полиморфного маркера rs12255372 гена TCF7L2 с метаболическими показателями глюкозотолерантности и функции β -клеток

	«СД2+» (п =440)				«СД2-«(п = 264)
Метаб. характеристики	G/G	G/T	Т/Т	Р	G/G	G/T	Т/Т	Р
Базальный уровень глюкозы (mmol/1)	9,3±1,8	10,3±1,6	10,7±1,9	0,018	5,4±0,5	6,2±0,6	5,9±0,4	н/д
Уровень глюкозы через 2 часа после ППГТ(тто1/1)	12Д±1,1	12,7±1,4	13,3±1,3	0,035	6,4±0,7	7,5±0,9	7,8±0,8	0,017
Базальный уровень инсулина (mU/1)	15,5±7,4	15,1±7,7	13,9±7,5	0,033	9,1±б,3	10,7±5,9	11,5±6,2	0,026
Уровень инсулина через 2 часа после ППГТ (mU/1)	90,7±33,5	89,5±31,3	79,8±33,3	0,018	50,6±20,1	46,4±19,0	43,7±19,2	0,035
НОМА-Ь	53,4±21,5	44,4±23,0	38,6±21,9	0,003	95,8±48,2	79,3±41,8	74,5±44,6	0,001

ППГТ, а также снижение индекса HOMA- β .

На основании полученных нами данных можно сделать вывод о том, что в русской популяции основную роль в развитии СД типа 2 играют гены, влияющие на уровень синтеза и секреции инсулина в β -клетках поджелудочной железы. В тоже время следует отметить, что один из полиморфных маркеров гена TCF7L2 не показал ассоциацию с развитием СД типа 2 в русской популяции, хотя в полногеномных поисках ассоциация этого гена с СД типа 2 была обнаружена.

Все эти данные говорят о важности исследования предрасполагающих генетических факторов, вклад которых в развитие заболевания существенно изменяется в зависимости от популяции. Выявление генетических маркеров риска СД типа 2 позволяет лучше понять основной патологический механизм развития этого заболевания и в соответствии с этим выбрать оптимальную терапию заболевания, а также использовать полученные данные для профилактики СД типа 2 у здоровых людей.