Ассоциированность эритроцитарных антигенов с характеристиками спермы жеребцов после криоконсервирования

Криоконсервирование спермы животных — важнейший способ сохранения исчезающих пород и видов. В коневодстве России и Украины это направление имеет особую актуальность из-за критического снижения численности поголовья племенных животных соответственно до 1,3 млн и до 300 тыс. гол. (1-3). Например, из 12 официально зарегистрированных украинских пород только для трех сохраняется минимально необходимая численность племенных жеребцов и кобыл (4). Поэтому повышение характеристик спермы жеребцов и расширение возможностей прогнозирования результативности криоконсервирования имеет большое научно-практическое значение.

В современной физиологии больше исследуется влияние микроорганизмов на основные характеристики спермы после криоконсервирования, что объясняется последующим применением заготовленных спермо-доз в системе искусственного осеменения лошадей (5-7). Изучается большое число других факторов, которые могут влиять на основные показатели спермограмм жеребцов: гормональный фон, порода, возраст, время года, общее физиологическое состояние, микотоксины, общая хромосомная нестабильность и др. (8-12). Ведутся работы по оценке эффективности криоконсервирования эпидидимального семени жеребцов (1).

В то же время ассоциированная связь эритроцитарных антигенов с показателями эякулятов после криоконсервирования практически не изучается (13-15), несмотря на то, что еще в 1940-х годах была доказана их ассоциация с фертильным потенциалом лошадей (16-18); лишь некоторые исследователи указывают на необходимость подобных работ (19-22). Если у человека сегодня официально признано 29 систем групп крови из 35 существующих (23), то у лошадей — лишь 9 подобных систем, из них наибольшее практическое значение имеют четыре: А, С, D, К, ассоциированная связь которых с показателями спермограмм после криоконсервирования не исследовалась. Показана возможность повышения оплодотво-ряемости кобыл при случке на основе учета влияния иммуногенетических маркеров, однако связь этих маркеров с показателями спермограмм жеребцов авторы не изучали (24). Единственное исследование биологических характеристик нативной спермы жеребцов в сочетании с антигенным профилем эритроцитов показало, что эти характеристики ассоциированы, но их связь с результативностью криоконсервирования не рассматривалась (4).

Мы впервые сопоставили антигенные характеристики эритроцитов А, С, D, К систем групп крови лошадей с основными свойствами спермы после криоконсервирования и показали, что высокая подвижность и выживаемость спермиев после криоконсервирования отмечается у особей с определенным набором эритроцитарных антигенов системы D, а отсутствие антигенов системы группы крови А сопровождается достоверным повышением биологического качества спермы после криоконсервирования.

Целью представленного исследования было установление ассоциированности между эритроцитарными антигенами А, С, D, К систем групп крови жеребцов и характеристиками их спермы после криоконсервирования.

Методика. Исследование выполняли на 1676 свежеполученных эякулятах, из которых 1413 проявили криорезистентность. Сперму получали от 69 жеребцов-производителей 9 заводских пород (украинская верховая, чистокровная верховая, тракененская, ганноверская, бельгийская, вестфальская, арабская, орловская рысистая и русская рысистая) конных заводов, племенных репродукторов, конно-спортивных клубов Харьковской, Полтавской, Запорожской, Луганской, Киевской, Житомирской, Днепропетровской областей (Украина) на протяжении 10 лет, начиная с 2005 года. Эякуляты отбирали на стерильную искусственную вагину со стерильным спермоприемником после санитарной обработкой жеребцов, при отборе и криоконсервировании спермы использовали харьковскую технологию (4, 9). В размороженной сперме общепринятыми методами (25) определяли активность спермиев в баллах (1 балл — 10 % спермиев с прямолинейнопоступательным движением) визуально в световом микроскопе Jenaval («Carl Zeiss», Германия) при увеличении объектива ½10-20, переживае-мость спермиев (в часах) — в термостате при 37 °С, абсолютный показатель переживаемости (в условных единицах), сохранность спермиев в процентах от исходной в нативной сперме. Показатели размороженной спер-736

мы анализировали по отдельности для аллелей каждой из систем групп крови (D, А, С, К). Иммуногенетическое генотипирование по эритроцитарным антигенам систем групп крови жеребцов проводили в реакции прямой агглютинации (РА) с применением стандартных моноспецифических сывороток-реагентов, которые верифицированы международными стандартными реагентами и произведены в лаборатории генетики Института животноводства НААН Украины (Aa, Ad, Ca, Da, Db, Dc, Dd, De, Dg, Dk, Ka), по общепринятым методикам (13). При определении генотипов жеребцов по группам крови в каждой системе определяли оба аллеля, унаследованные от родителей. Обозначали генотипы через черту: аллель до черты унаследован от отца, аллель после черты — унаследован от матери.

Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методиками вариационной статистики, достоверность различий оценивали по t -критерию Стьюдента (26). В таблицах приведены средние ( M ) и средние отклонения (±SEM). Дисперсионный анализ выполняли с использованием специализированного пакета прикладных программ SPSS for Windows (непараметрическая статистика) («IBM», США).

Результаты. Экспериментальные данные по установлению ассоциаций эритроцитарных антигенов системы группы крови D с характеристиками спермы после криоконсервирования представлены в таблице 1.

1. Ассоциированность аллелей эритроцитарных антигенов системы группы крови D (ЭА D) с характеристиками спермы жеребцов после криоконсервирования (М±SEM, п = 1413)

ЭА D	Число проб	Активность спермиев, балл	Переживаемость спермиев		Сохранность спермиев, %
			при 37 °С, ч	1абсолютная, усл. ед.
		Низкое качество спермы
аd / bcm	17	2,12±0,23	2,12±0,23	4,62±0,66	42,94±4,57
ad / cgm	12	2,37±0,26	2,79±0,32	5,79±0,67	47,22±5,42
ad / d	16	1,93±0,29	1,93±0,29	4,50±0,71	38,54±5,91
ad / de	36	2,06±0,23	2,01±0,21	5,26±0,68	37,68±4,11
ad / dk	14	1,39±0,27	1,50±0,31	3,32±0,71	27,65±5,42
cgm / ceg	15	1,53±0,33	1,63±0,35	3,53±0,81	28,32±5,72
cgm / dk	45	2,51±0,09	2,84±0,12	7,57±0,47	47,52±1,90
de / cgm	8	2,10±0,29	2,25±0,34	5,1±0,79	40,90±6,10
dg / cgm	14	2,11±0,29	2,46±0,35	5,11±0,75	42,90±5,45
dg / di	16	1,47±0,31	1,50±0,32	3,63±0,85	26,14±5,10
		Среднее качество спермы
bcm / cgm	103	3,60±0,19**	3,00±0,15**	9,91±0,61**	50,13±2,47*
bcm / de	91	3,53±0,17**	3,11±0,14**	9,59±0,48**	52,57±2,17*
bcm / dg	65	3,38±0,13**	3,43±0,19**	10,40±0,68***	52,84±1,43*
bcm / dk	115	3,59±0,11**	3,70±0,11**	11,80±0,46***	54,30±1,36*
cegm / cgm	27	3,24±0,11**	3,68±0,16**	9,87±0,43**	54,63±1,27**
cegm / d	20	3,25±0,11**	3,55±0,13**	10,70±0,47***	52,60±0,84*
cegm/dg	27	3,18±0,12**	3,67±0,15**	9,67±0,45**	55,50±1,54**
cegm / dk	37	3,33±0,17**	3,54±0,25**	10,90±0,91***	57,31±2,46**
cgm / cgm	72	2,92±0,11*	3,37±0,15**	8,10±0,38**	51,87±1,79*
cgm / d	29	3,93±0,47**	2,17±0,19*	8,27±0,99**	49,80±5,70*
cgm / dg	58	2,98±0,17*	3,24±0,20*	9,49±0,73**	48,18±2,57*
de / d	27	3,80±0,48***	2,02±0,21*	7,59±0,95*	47,20±6,05
de / dk	88	3,18±0,13**	3,47±0,15**	10,24±0,55***	51,90±1,70*
dk / d	67	3,37±0,11**	3,60±0,14**	10,61±0,49***	53,30±1,54**
dk / de	25	3,34±0,12**	3,44±0,16**	11,36±0,73***	58,27±1,77**
dk / dk	30	3,74±0,17***	3,15±0,15**	12,35±0,91***	59,23±2,08**
		Высокое качество спермы
bcm / d	27	4,33±0,11***	5,03±0,12***	14,94±2,67***	67,12±0,87***
cgm / de	48	4,67±0,18***	5,19±0,21***	16,45±0,75***	61,90±2,29***
dg / dk	19	4,34±0,33***	4,71±0,36***	15,90±1,32***	56,34±4,30**

*, **, *** Различия с вариантом для спермы низкого качества статистически значимы соответственно при Р < 0,05; Р < 0,01 и Р < 0,001.

Из полученных данных (см. табл. 1) видно, что наличие у обследованных лошадей аллелей эритроцитарных антигенов аd / bcm , ad / cgm , ad / d , ad / de , ad / dk , cgm / ceg , cgm / dk , de / cgm , dg / cgm , dg / di системы группы крови

D сопровождалось проявлением низкого качества спермы после криоконсервирования (подвижность сперматозоидов после оттаивания менее 2,5 балла и низкая выживаемость — менее 2,5 ч). Средние физиологические характеристики спермы (подвижность спермиев от 2,5 балла и выживаемость до 4 ч) отмечали при наличии у жеребцов украинской селекции аллелей эритроцитарных антигенов bcm / cgm , bcm / de , bcm / dg , bcm / dk , cegm / cgm , cegm / d , cegm / dg , cegm / dk , cgm / cgm , cgm / d , cgm / dg , de / d , de / dk , dk / d , dk / de , dk / dk системы группы крови D. Высокую результативность криоконсервирования спермы (подвижность более 4 баллов и выживаемость 4 ч) наблюдали у жеребцов с аллелями эритроцитарных антигенов bcm / d , cgm / de , dg / dk системы группы крови D.

Установлено, что степень влияния эритроцитарных антигенов системы группы крови D на криорезистентность спермы составила 32,5 % (Р < 0,001), на подвижность размороженных спермиев — 18,2 % (Р < 0,01), на их выживаемость — 25,2 % (Р < 0,001), на абсолютный показатель пе-реживаемости размороженной спермы — 24,5 % (Р < 0,01) и на сохранность оттаянной спермы — 12,2 % (Р < 0,05).

2. Ассоциированность аллелей эритроцитарных антигенов системы группы крови А (ЭА А) с характеристиками спермы жеребцов после криоконсервирования ( М ±SEM, п = 1413)

ЭА А	Число проб	Активность спермиев, балл	Переживаемость спермиев		Сохранность спермиев, %
			при 37 °С, ч1	абсолютная, усл. ед.
- / -	101	Опыт 3,42±0,11*      3,45±0,11**		10,88±0,49*	54,97±1,38*
а / -	8	2,06±0,29*	2,25±0,34	5,06±0,78**	40,88±6,09
аd / -	1059	3,25±0,05	3,26±0,05*	9,72±0,17*	50,92±0,60
Не определяли	245	Ко 2,91±0,09	нтроль 2,71±0,08	8,09±0,31	46,21±1,27

*, **, *** Различия с контролем статистически значимы соответственно при Р < 0,05; Р < 0,01 и Р < 0,001.

Анализ основных характеристик криоконсервированной спермы у лошадей украинской селекции в сопоставлении с аллелями системы группы крови А (табл. 2) позволяет заключить, что биологическое качество такой спермы достоверно повышалось при отсутствии у жеребцов эритроцитарных антигенов этой системы. Так, активность спермиев была больше на 0,51 балла (Р < 0,05), чем в контроле, на 1,36 балла (Р < 0,01) — в сравнении с таковой у носителей а /- аллеля и на 0,17 балла — в сравнении с производителями с аd /- аллелями. Переживаемость размороженной спермы оказалась наибольшей у жеребцов с отсутствием антигенов А системы — на 0,74 ч больше контрольной (Р < 0,05), на 1,2 ч (Р < 0,001) — в сравнении с носителями а /- аллеля и на 0,19 ч — для носителей аd /- аллеля. Наследование жеребцами а /- эритроцитарного антигена системы группы крови А сопровождалось худшей сохранностью спермиев (менее 41 %).

Степень влияния эритроцитарных антигенов системы группы крови А на криорезистентность спермы составила 3,4 % (Р < 0,05), на подвижность спермиев после размораживания — 1,2 % (Р < 0,05), на выживаемость оттаянных спермиев — 2,4 % (Р < 0,05), на абсолютный показатель переживаемости размороженной спермы — 2,1 % (Р < 0,05) и на сохранность оттаянной спермы —1,4 % (Р < 0,05).

Результаты исследования основных физиологических характеристик спермы жеребцов в зависимости от наличия эритроцитарных антигенов системы группы крови С (табл. 3) свидетельствуют, что присутствие а/- сопровождается достоверным (Р < 0,05) ухудшением активности (на 0,33 балла), переживаемости (на 0,78 ч), абсолютного показателя пережива-емости (на 1,84 усл. ед.), сохранности спермиев (на 6,26 %) в сравнении с аналогичными показателями жеребцов, у которых отсутствуют эритроцитарные антигены этой системы группы крови.

3. Ассоциированность аллелей эритроцитарных антигенов системы группы крови С (ЭА С) с характеристиками спермы жеребцов после криоконсервирования ( М ±SEM, п = 1413)

ЭА С	Число проб	Активность	Переживаемость спермиев	Сохранность
		спермиев, балл	при 37 °С, ч1 абсолютная, усл. ед.	спермиев, %

Опыт

- / -	940	3,32±0,05*	3,42±0,05*	10,15±0,17*	52,42±0,57*
а / -	227	2,99±0,12	2,64±0,11	8,31±0,40	46,16±1,61
			Контроль
Не определяли	245	2,91±0,09	2,71±0,08	8,09±0,31	46,21±1,27

*, **, *** Различия с контролем статистически значимы соответственно при Р < 0,05; Р < 0,01 и Р < 0,001.

Установлено, что степень влияния эритроцитарных антигенов системы группы крови С на активность спермиев жеребцов украинской селекции после размораживания составила 1,4 % (Р < 0,05), на переживае-мость спермы — 5,6 % (Р < 0,05), на абсолютный показатель переживае-мости — 3,1 % (Р < 0,05) и на сохранность спермиев — 2,4 % (Р < 0,05).

При отсутствии у жеребцов антигенов системы группы крови К активность размороженной спермы была выше на 0,35 балла (Р < 0,05), чем у носителей аллеля а /- антигена К системы, и на 0,40 балла (Р < 0,05), чем у контрольных лошадей, у которых не определяли антигенный профиль эритроцитов. Степень влияния эритроцитарных антигенов системы группы крови К на активность спермиев после размораживания составила 1,4 % (Р < 0,05), на переживаемость спермы — 2,0 % (Р < 0,05), на абсолютный показатель переживаемости — 1,5 % (Р < 0,05) и на сохранность спермиев — 1,2 % (Р < 0,05).

Обобщающий дисперсионный анализ полученных данных показал, что степень влияния антигенных характеристик эритроцитов на криорезистентность спермы жеребцов украинской селекции составляет для системы группы крови D — 38,7 % (Р < 0,001), для А — 1,7 % (Р < 0,05), для С — 16,6 % (Р < 0,01) и для системы К — 12,9 % (Р < 0,01).

Таким образом, у лошадей украинской селекции впервые проведены исследования ассоциированности эритроцитарных антигенов систем А, С, D, К с основными характеристиками спермы после криоконсервирования. Показано, что наличие у обследованных животных аллелей эритроцитарных антигенов аd/bcm, ad/cgm, ad/d, ad/de, ad/dk, cgm/ceg, cgm/dk, de/cgm, dg/cgm, dg/di системы группы крови D сопровождалось низкой подвижностью спермиев (менее 2,5 балла) и низкой выживаемостью (менее 2,5 ч). Среднюю по качеству криоконсервированную сперму (подвижность от 2,5 балла и выживаемость до 4 ч) получали у жеребцов с аллелями эритроцитарных антигенов bcm/cgm, bcm/de, bcm/dg, bcm/dk, cegm/cgm, cegm/d, cegm/dg, cegm/dk, cgm/cgm, cgm/d, cgm/dg, de/d, de/dk, dk/d, dk/de, dk/dk системы группы крови D. Высокие характеристики спермы после криоконсервирования (подвижность спермиев более 4 баллов и выживаемость более 4 ч) отмечали у жеребцов с генотипом по эритроцитарным антигенам системы группы крови D bcm/d, cgm/de, dg/dk. Доля влияния антигенных характеристик системы группы крови D на криорезистентность сперматозоидов жеребцов составила 32,5 % (Р < 0,001), на подвижность — 18,2 % (Р < 0,01), на выживаемость оттаянной спермы — 25,2 % (Р < 0,001), на абсолютный показатель переживаемости — 24,5 % (Р < 0,01) и на сохранность оттаянной спермы — 12,2 % (Р < 0,05). В отсутствие антигенов системы группы крови К активность размороженной спермы была выше на 0,35 балла (Р < 0,05), чем у носителей аллеля а/- К системы, и на 0,40 балла (Р < 0,05), чем у контрольных производителей, у которых не определяли антигенный профиль эритроцитов. Наличие аллеля а/- (система группы крови С) сопровождалось достоверным (Р < 0,05) снижением активности (на 0,33 балла), переживаемости (на 0,78 ч), абсолютного показателя переживаемости (на 1,84 усл. ед.), сохранности спермиев (на 6,26 %) в сравнении с показателями жеребцов, у которых отсутствуют эритроцитарные антигены этой системы группы крови. Отсутствие антигенов системы группы крови А приводило к достоверному повышению биологических характеристик спермы после криоконсервирования.