Аттрактивные и иммуносупрессивные свойства летучих выделений, индуцированных у мышей раздельными и сочетанными воздействиями ионизирующей радиации и химических соединений

Известно, что радиационные инциденты сопровождаются воздействием на организм пострадавших не только ионизирующей радиации, но и химических веществ. Между тем, фундаментальные и прикладные исследования, направленные на решение различных аспектов этой проблемы, в подавляющем большинстве посвящены последствиям воздействия радиации, но в значительно меньшем объеме сочетанным эффектам с химическими веществами. Важность этой проблемы отражена в предложении – рассматривать радиационные катастрофы как радиационно-токсические [5]. Сложность анализа последствий таких инцидентов обусловлена и тем, что их развитие в группах сопровождается вкладом эмоционально-психологических эффектов [5]. Ранее было установлено, что в последствиях воздействия ионизирующей радиации в группах животных значительную роль играют летучие компоненты (ЛК), выделяемые облученными особями с мочой. Такие ЛК, как было показано, обладают иммуносупрессивным эффектом на интактных членов группы, влияют на их поведенческие реакции и вызывают своего рода цепную реакцию умножения и распространения пострадиационных нарушений в группе [ 7 11]. Этот эффект может рассматриваться как аналог известного в медицине катастроф так называемого семантического стресса, которым объясняют появление нарушений различных показателей, в том числе и иммунитета, у лиц, непосредственно не затронутых повреждающим воздействием, но коммуникативно-вовлеченных в поставарийную ситуацию [4].

Было также установлено, что мыши, подвергнутые воздействию ионизирующей радиации в сублетальных дозах [10], солей тяжелых металлов [14] или иммунодепрессантов [13], помимо ЛК, влияющих на поведенческие реакции, выделяют с мочой ЛК, которые угнетают первичный тимусзависимый ответ у интактных мышей. Свойства ЛК, продуцируемых после сочетанных воздействий радиации и нерадиационных факторов как в отношении влияния на поведенческие, так и иммунные реакции, не изучены.

В связи с вышесказанным, актуальным представляется изучение свойств ЛК, индуцированных раздельным или сочетанным воздействием ионизирующей радиации и токсических веществ.

В настоящей работе в качестве индукторов ЛК были использованы раздельные и сочетанное воздействия ионизирующей радиации в сублетальных дозах и таких химических соединений (ХС), как бензол (БЗ) и его метаболит гидрохинон (ГХ), который обладает свойствами радиотоксинов [1].

Материалы и методика

Эксперименты выполнены на мышах-самцах СВА массой 25-30 г, полученных из питомника “Столбовая” и содержавшихся в условиях вивария на обычном пищевом рационе. Животных выдерживали не менее двух недель до начала эксперимента в одних и тех же стандартных пластиковых боксах.

Нами были исследованы свойства ЛК, продуцируемые с мочой, после тотального облучения мышей гамма-лучами ⁶⁰ Со на установке “Гамма-целл-220” (“Atomic Energy Canada Limited”, Канада) с мощностью 18,1 сГр/мин в дозе 2 или 4 Гр, а так же после введения БЗ или ГХ, соответственно, в дозах 2,8 г/кг и 100 мг/кг в 0,3 мл физиологического раствора подкожно или после сочетанного воздействия ионизирующей радиации и перечисленных ХС в указанных дозах. Контролем для группы облученных мышей служили ложно облученные мыши; контролем для групп мышей, получивших ХС, были мыши, которым вводили по 0,3 мл физиологического раствора подкожно; контролем для животных, подвергнутых сочетанным воздействиям, служили ложно облученные мыши с введением 0,3 мл физиологического раствора подкожно.

При изучении относительной аттрактивности интактных мышей-реципиентов к ЛК, выделяемым сравниваемыми группами животных, использовали образцы мочи, впитавшейся в течение суток в бумажную подстилку (лист фильтровальной бумаги), помещенную в разные сроки после вышеуказанных воздействий под сетчатое дно из нержавеющей стали боксов, в которых содержались животные контрольной или подопытных групп.

Для исследования аттрактивных свойств ЛК применяли модификацию Т-образного лабиринта [7, 12], в котором имелось “поле выбора” размером 50x50 см с высотой стенок 35 см, над ним на расстоянии 50 см находилась галогенная лампа мощностью 100 Вт. С противоположных внешних сторон “поля” находились два “укрытия” (светонепроницаемые пластиковые коробки 15x10x5 см), в которые мыши-тестеры могли свободно проникать через отверстия в стенках поля. Мышей-тестеров (10 самцов СВА) помещали по шесть раз на середину “поля” и наблюда- ли, какое из “укрытий” выберет данная особь. Положительным выбором – предпочтением – считалась окончательная задержка особи-тестера в определенном “укрытии” без попытки выхода не менее 0,5 минуты. Величину относительной аттрактивности оценивали по частоте предпочтения – выбору интактными мышами-тестерами одного из “укрытий”, содержащих подстилки с образцами мочи от сравниваемых групп. Частоту предпочтения рассчитывали по формуле П=(У:60)х100 %, где У - количество предпочтений “укрытия” из 60 возможных. Достоверность различий определяли с помощью критерия парного сравнения Вилкоксона.

По окончании эксперимента мы оценивали относительную аттрактивность образцов мочи от следующих сравниваемых групп мышей-доноров ЛК: контроль/облучение 2 Гр (К/2 Гр); кон-троль/ХС (К/ХС); облучение 2 Гр/ХС (2 Гр/ХС); контроль/облучение 2 Гр+ХС (К/2 Гр+ХС); облучение 2 Гр/облучение 2 Гр+ХС (2 Гр/2 Гр+ХС); ХС/облучение 2 Гр+ХС (ХС/2 Гр+ХС). В другой серии опытов сравниваются аналогичные группы, но c дозой радиации 4 Гр и с такими же дозами ХС.

Для оценки иммуномодулирующих свойств рассматриваемых ЛК образцы мочи на бумажной подстилке, полученные в течение третьих суток после раздельных или сочетанных воздействий ионизирующей радиации и ХС, переносили к интактным мышам-реципиентам под сетчатое дно бокса. В контрольной группе использовали образцы мочи от другой группы интактных мышей. Через одни сутки после экспозиции мышей-реципиентов иммунизировали ЭБ в дозе 1х10 8 клеток/мышь. На четвертые сутки после иммунизации их декапитировали под эфирным наркозом и определяли содержание антителообразующих клеток (АОК) методом Каннингема. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты

При исследовании аттрактивных свойств рассматриваемых ЛК во всех случаях определяли частоту относительных предпочтений интактными тестерами двух сравниваемых образцов мочи. Сравнение ЛК, содержащихся в моче контрольных, интактных мышей, с ЛК облученных в дозе 2 или 4 Гр обнаружило более высокую аттрактивность пострадиационных ЛК (здесь и далее приведены только достоверные результаты). Тестеры предпочитали “укрытия” с образцами мочи, полученными в течение 2-х и 3-х суток после облучения в дозе 2 Гр (табл. 1 и 3; группы К/2 Гр) и с 1-х по 7-е сутки после воздействия в дозе 4 Гр (табл. 2 и 4; группы К/4 Гр).

Аналогичный эксперимент с оценкой свойств ЛК, индуцированных введением БЗ, выявил их аверсивность – пониженную их аттрактивность по сравнению с контролем (табл. 1 и 2, группы К/БЗ). Мыши-тестеры избегали “укрытия” с образцами мочи, полученными в течение 10 суток после введения БЗ, предпочитая ЛК контрольных животных. Отталкивающими интактных тестеров, аверсивными свойствами обладали и ЛК, индуцированные в течение 3-х суток введением ГХ (табл. 3 и 4, группы К/ГХ).

Таблица 1

Относительная аттрактивность (M±m, %) интактных мышей к ЛК особей, подвергнутых раздельным и сочетанным воздействиям радиации (2 Гр) и БЗ

Время после воздействия, сут	Сравниваемые группы
	К/2 Гр	К/БЗ	2 Гр/БЗ	К/2 Гр+БЗ	2 Гр/2 Гр+БЗ	БЗ/2 Гр+БЗ
1	46,7/53,3	55,0*/45,0	53,3*/46,7	51,7/48,3	53,3*/46,7	43,3/56,7*
2	43,3/56,7*	55,0*/45,0	56,7*/43,3	50,0/50,0	56,7*/43,3	45,0/55,0*
3	45,0/55,0*	56,7*/43,3	56,7*/43,3	43,3/56,7*	58,3*/41,7	43,3/56,7*
4	53,3/46,7	58,3*/41,7	53,3/46,7	51,7/48,3	55,0*/45,0	43,3/56,7*
7	50,0/50,0	73,3*/26,7	55,0*/45,0	58,3*/41,7	55,0*/45,0	46,7/53,3
8	48,3/51,7	60,0*/40,0	58,3*/41,7	58,3*/41,7	53,3*/46,7	48,3/51,7
10	-	61,7*/38,3	56,7*/43,3	56,7*/43,3	53,3*/46,7	46,7/53,3
13	-	48,3/51,7	46,7/53,3	50,0/50,0	51,7/48,3	48,3/51,7
14	-	53,3/46,7	50/50	48,3/51,7	51,7/48,3	51,7/48,3
15	-	48,3/51,7	48,3/51,7	48,3/51,7	51,7/48,3	51,7/48,3

Примечание: * - достоверное предпочтение по парному критерию Вилкоксона.

Таблица 2

Относительная аттрактивность (M±m, %) интактных мышей к ЛК особей, подвергнутых раздельным и сочетанным воздействиям радиации (4 Гр) и БЗ

Время после воздействия, сут	Сравниваемые группы
	К/4 Гр	К/Б	Гр/БЗ	К/Гр+БЗ	4 Гр/Гр+БЗ	БЗ/Гр+БЗ
1	40,0/60,0*	56,7*/43,3	60,0*/40,0	48,3/51,7	55,0*/45,0	45,0/55,0*
2	43,3/56,7*	56,7*/43,3	58,3*/41,7	45,0/55,0	58,3*/41,7	41,7/58,3*
3	38,3/61,7*	61,7*/38,3	71,7*/28,3	41,7/58,3*	70,0*/30,0	43,3/56,7*
4	43,3/56,7*	58,3*/41,7	56,7*/43,3	43,3/56,7*	61,7*/38,3	45,0/55,0*
7	40,0/60,0*	61,7*/38,3	56,7*/43,3	58,3/41,7	55,0*/45,0	45,0/55,0*
8	50,0/50,0	60,0*/40,0	58,3*/41,7	56,7*/43,3	55,0*/45,0	48,3/51,7
10	48,3/51,7	56,7*/43,3	63,3*/36,7	55,0*/45,0	56,7*/43,3	50,0/50,0
13	53,3/46,7	48,3/51,7	45,0/55,0	48,3/51,7	48,3/51,7	46,7/53,3
14	46,7/53,3	53,3/46,7	46,7/53,3	50,0/50,0	53,3/46,7	48,3/51,7
15	48,3/51,7	48,3/51,7	51,7/48,3	46,7/53,3	50,0/50,0	48,3/51,7

Примечание: * - достоверное предпочтение по парному критерию Вилкоксона.

Таблица 3

Относительная аттрактивность (M±m, %) интактных мышей к ЛК особей, подвергнутых раздельным и сочетанным воздействиям радиации (2 Гр) и ГХ

Время после воздействия, сут	Сравниваемые группы
	К/2 Гр	К/ГХ	2 Гр/ГХ	К/2 Гр+ГХ	2 Гр/2 Гр+ГХ	ГХ/ 2 Гр+ГХ
1	46,7/53,3	56,7*/43,3	60,0*/40,0	53,3/46,7	61,7*/38,3	41,7/58,3*
2	41,7/58,3*	58,3*/41,7	56,7*/43,3	48,3/51,7	60,0*/40,0	43,3/56,7*
3	40,0/60,0*	58,3*/41,7	58,3*/41,7	51,7/48,3	58,3*/41,7	40,0/60,0*
4	53,3/46,7	46,7/53,3	51,7/48,3	55,0/45,0	51,7/48,3	50,0/50,0
6	48,3/51,7	46,7/53,3	55,0/45,0	55,0/45,0	51,7/48,3	48,3/51,7
7	48,3/51,7	51,7/48,3	51,7/48,3	50,0/50,0	51,7/48,3	48,3/51,7

Примечание: * - достоверное предпочтение по парному критерию Вилкоксона.

Таблица 4

Относительная аттрактивность (M±m, %) интактных мышей к ЛК особей, подвергнутых раздельным и сочетанным воздействиям радиации (4 Гр) и ГХ

Время после воздействия, сут	Сравниваемые группы
	К/4 Гр	К/ГХ	4 Гр/ГХ	К/4 Гр+ГХ	4 Гр/4 Гр+ГХ	ГХ/4 Гр+ГХ
1	40,0/60,0*	60,0*/40,0	60,0*/40,0	45,0/55,0*	55,0*/45,0	45,0/55,0*
2	43,3/56,7*	65,0*/35,0	58,3*/41,7	46,7/53,3	58,3*/41,7	33,3/66,7*
3	38,3/61,7*	68,3*/31,7	56,7*/43,3	40,0/60,0*	61,7*/38,3	38,3/61,7*
4	43,3/56,7*	56,7/43,3	56,7*/43,3	46,7/53,3	55,0*/45,0	36,7/63,3*
7	40,0/60,0*	53,5/46,7	56,7*/43,3	46,7/53,3	56,7/43,3	43,3/56,7*
8	50,0/50,0	50,0/50,0	48,3/51,7	46,7/53,3	51,7/48,3	48,3/51,7

Примечание: * - достоверное предпочтение по парному критерию Вилкоксона.

При сравнении аттрактивных свойств ЛК, продуцируемых мышами после облучения в дозах 2 и 4 Гр и после введения БЗ, мыши-тестеры предпочитали образцы мочи облученных особей (табл. 1, группы 2 Гр/БЗ; табл. 2, группы 4 Гр/БЗ). Эффект наблюдался в течение 10 суток независимо от дозы радиации.

В аналогичном эксперименте с введением ГХ мыши-тестеры также предпочитали “укрытия” с образцами мочи от облученных животных: в течение 3-х суток после облучения в дозе 2 Гр (табл. 3; группы 2 Гр/ГХ) и с 1-х по 7-е сутки - образцы мочи облученных в дозе 4 Гр мышей (табл. 4, группы 4 Гр/ГХ).

Выделение животными ЛК, существенно различающихся по влиянию на реакцию предпочтения-избегания, наблюдали и при сочетанных воздействиях радиации и ХС. Так, в случае ГХ сочетанный эффект зависел от дозы радиации. При минимальной использованной здесь дозе (2 Гр) достоверных различий в предпочтении ЛК какой-либо из сравниваемых групп (табл. 3, группы К/2 Гр+ГХ) не обнаружено. При повышении дозы радиации до 4 Гр (табл. 4, группы К/4 Гр+ГХ) в первые и третьи сутки преобладают аттрактивные пострадиационные выделения. В случае же БЗ подобных закономерностей не выявлено (табл. 1, группы К/2 Гр+БЗ; табл. 2, группы К/4 Гр+БЗ). На третьи сутки (табл. 1) или с третьих по четвертые сутки (табл. 2) преобладает аттрактивность ЛК, индуцированных сочетанными воздействиями радиации и БЗ. С седьмых по десятые сутки (табл. 1) или с восьмых по десятые сутки (табл. 2) предпочтительными для интактных самцов становятся ЛК контрольных интактных животных.

В опытах сравнения аттрактивных свойств ЛК таких групп, как 2 Гр/2 Гр+БЗ (табл. 1) и 2 Гр/2 Гр+ГХ (табл. 3), а также групп 4 Гр/4 Гр+БЗ (табл. 2) и 4 Гр/4 Гр+ГХ (табл. 4) были получены данные, которые подобны результатам сравнения групп К/БЗ (табл. 1 и 2) и К/ГХ (табл. 3 и 4). Вероятно, что при сочетанном воздействии выделяющиеся ЛК с противоположно направленными свойствами взаимно нейтрализуются.

Сравнение аттрактивных свойств ЛК мышей, получивших ХС, и мышей после сочетанного воздействия радиации и ХС также свидетельствует о доминировании аттрактивных свойств пострадиационных ЛК (табл. 1-4).

С первых по четвертые сутки (табл. 1, группы БЗ/2 Гр+БЗ) и с первых по третьи сутки (табл. 3, группы ГХ/2 Гр+ГХ) наблюдалась повышенная привлекательность ЛК, продуцируемых после сочетанного воздействия. С увеличением дозы радиации до 4 Гр данный эффект сохра- няется, но более протяженно - с первых по седьмые сутки (табл. 2, группы БЗ/4 Гр+БЗ; табл. 4, группы ГХ/4 Гр+ГХ).

В данной работе было также исследовано влияние ЛК, индуцированных вышеуказанными воздействиями, на иммунологическую реактивность мышей-реципиентов, оцениваемую по содержанию АОК в селезенке. Так, содержание АОК в селезенке группы реципиентов, экспонированных с ЛК облученных в дозе 2 Гр животных, не отличалось от контрольного уровня, но было снижено при увеличении дозы радиации до 4 Гр (табл. 5). У реципиентов, экспонированных с ЛК мышей, получивших БЗ или ГХ, количество АОК в селезенке было снижено по сравнению с контрольной группой (1-4 серии опытов).

Таблица 5

Иммунологические показатели (М±т) у интактных мышей после экспозиции с ЛК интактных особей или подвергнутых изолированным и сочетанному воздействию радиации (2, 4 Гр) и БЗ или ГХ

Группа животных-доноров ЛК	Количество АОК в селезенке, 1 х 103
1 серия опытов
ЛК мышей контрольной группы	151±16,7 (100±11,1)
ЛК облученных мышей, 2 Гр	114±11,5 (75,4±7,7)
ЛК мышей, получивших БЗ	82±4,9 (54,7±3,3)*
ЛК мышей, получивших БЗ+облучение 2 Гр	60±7,7 (39,8±5,1)* '*'°
2 серия опытов
ЛК мышей контрольной группы	72±13,3 (100±4,6)
ЛК облученных мышей, 4 Гр	56,2±5,2 (77,8±7,7)*
ЛК мышей, получивших БЗ	38,4±7,4 (53,3±10,2)*
ЛК мышей, получивших БЗ+облучение 4 Гр	25,5±5,7 (35,4±7,9)* '"
3 серия опытов
ЛК мышей контрольной группы	178±13,4 (100±7,5)
ЛК облученных мышей, 2 Гр	224±18,9 (125,8±10,6)
ЛК мышей, получивших ГХ	106±6,5 (59,8±3,7)* '"
ЛК мышей, получивших ГХ+облучение 2 Гр	147±3,4 (82,6±1,9)* '*'°
4 серия опытов
ЛК мышей контрольной группы	226±19,2 (100±7,2)
ЛК облученных мышей, 4 Гр	163±20,0 (61,4±7,2)*
ЛК мышей, получивших ГХ	146±25,5 (54,8±9,6)*
ЛК мышей, получивших облучение 4 Гр+ГХ	169±11,3 (63,6±4,3)*

Примечание: * - Р<0,05 по критерию Стьюдента относительно контроля;

• • - Р<0,05 по критерию Стьюдента относительно группы облученных мышей;

• ◊ - Р<0,05 по критерию Стьюдента относительно группы животных, получивших БЗ или ГХ; в скобках - % к контролю.

Иммунологические показатели мышей, экспонированных с ЛК особей, подвергнутых сочетанному воздействию ионизирующей радиации и ХС, также отличались от контроля. Содержание в селезенке АОК было снижено у мышей, экспонированных с ЛК особей, подвергнутых сочетанному воздействию радиации и БЗ, а также групп облученных (2 Гр) или получивших БЗ особей (1 серия опытов).

Во второй серии опытов у мышей, экспонированных с ЛК особей, получивших БЗ и облученных в дозе 4 Гр, аналогичные показатели были достоверно снижены относительно контроля и эффекта ЛК облученных особей без введения БЗ.

В 3-й серии опытов подопытные группы животных были подвергнуты раздельному и сочетанному воздействиям радиации (2 Гр) и ГХ. Количество АОК в селезенке особей, которых экспонировали с ЛК мышей, получивших ГХ, было достоверно снижено относительно контроля и группы животных, экспонированных с ЛК облученных 2 Гр животных. У мышей, экспонированных с ЛК особей, получивших ГХ в сочетании с облучением, данный показатель отличался от контроля, а также от группы экспонированных с ЛК облученных в дозе 2 Гр, или экспонированных с ЛК группы животных, получивших ГХ.

Экспонирование реципиентов с ЛК мышей, облученных в дозе 4 Гр и получивших ГХ (4-я серия опытов) привело к снижению содержания АОК в селезенке относительно контрольной группы животных. По отношению к другим подопытным группам достоверных изменений не обнаружено.

Обсуждение результатов

Представленные выше данные свидетельствуют о том, что способностью индуцировать у животных выделение с мочой отсутствующих в норме ЛК обладает не только ионизирующая радиация, но и органические химические вещества, а также сочетание этих факторов. Продуцируемые при этом ЛК модифицируют поведенческие и иммунные реакции у интактных особей, и, следовательно, модифицируют механизмы хемосигнализации в группах и популяциях.

Имеющиеся в литературе сведения о роли летучих хемосигналов в жизнедеятельности животных преимущественно относятся к физиологическим условиям. С их помощью регулируются зоосоциальное поведение, репродуктивная и другие функции [2, 3, 6, 16]. Среди немногочисленных сведений о хемосигналах, выделяемых при патологических состояниях [2, 7, 17, 19], доминируют данные об аттрактивных и иммуносупрессивных пострадиационных ЛК [10, 11].

Среди представленных выше данных примечательным является и тот факт, что аттрактивные и аверсивные свойства ЛК, наблюдаемые при раздельных воздействиях радиации и ХС, взаимно компенсируются в случае сочетанных воздействий данных факторов. Это позволяет предполагать, что образование хемосигналов с противоположными свойствами осуществляется независимо. Следовательно, различаются и механизмы их индукции воздействием радиации или ХС.

Механизмы синтеза физиологически-значимых хемосигналов и выделения их с мочой, химическая их структура остаются мало изученными [3]. Считается, что физиологический эф- фект хемосигналов может быть обусловлен не одним, а сочетанием нескольких индивидуальных веществ [18, 20]. Ранее была установлена способность животных продуцировать как хемосигналы с аттрактивными свойствами при воздействии ионизирующей радиации в сублетальных дозах, так и аверсивные хемосигналы, которые появляются в терминальный период после её воздействия в летальных дозах [7]. Между тем, аверсивные хемосигналы, как показано в данной работе, индуцируют и химические вещества.

Справедливым, возможно, является представление о том, что животные обладают механизмами неспецифической хемосигнализации другим особям группы о наличии патологического состояния [7], отражая при этом глубину и стадию поражения. Такие хемосигналы способны дистанционно различным образом модифицировать не только поведенческие и иммунные реакции животных в группах и популяциях, но и, как свидетельствуют многочисленные данные [2, 3, 6, 15-20], существенно влиять на их репродуктивное поведение. Для прогноза экологических последствий влияния рассматриваемых ЛК немаловажным является также ранее показанный эффект распространения и умножения обусловленных хемосигналами нарушений в группах животных [9].

Заключение

Таким образом, представленные результаты сравнительной оценки аттрактивных свойств рассматриваемых ЛК свидетельствуют о том, что они обладают разнонаправленным влиянием на поведенческие реакции интактных животных. Ионизирующая радиация в сублетальных дозах индуцирует выделение аттрактивных, привлекающих интактных мышей ЛК. Свойства этих ЛК в некоторой степени зависят от дозы ионизирующей радиации, что отражается в продолжительности их выделения. Введение БЗ или ГХ приводит к появлению аверсивных ЛК, отталкивающих интактных особей. При сочетанных воздействиях радиации и ХС, как можно предполагать, выделение ЛК с противоположными свойствами происходит независимо. В пользу этого свидетельствует взаимная компенсация их влияния на поведение животных.

Как аттрактивные, так и аверсивные ЛК, индуцированные рассматриваемыми факторами, способны снижать иммунную реактивность интактных особей.

Следовательно, сочетанные или раздельные воздействия радиации и химических веществ на животных сопровождаются выделением различных летучих хемосигналов, которые индуцируют у других особей нарушения поведенческих и иммунных реакций, что может иметь существенные экологические последствия.

Исследования проведены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Правительства Калужской области (проект № 09-04-97505).