B-эндорфин и селективные агонисты опиатных рецепторов в регуляции пролиферативного ответа лимфоцитов. Роль блокады опиатных рецепторов

Опиоидные пептиды являются одними из важнейших посредников во взаимодействии нервной и иммунной систем и играют ключевую роль в процессах адаптации организмов к меняющимся условиям окружающей среды (Корнева и др., 1988; Madden et al., 1995; Bidlack, 2000; Voccarino et al., 2000). Ведущая роль в процессе формирования адаптации со стороны иммунной системы принадлежит факторам, участвующим в запуске процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов, непосредственно выполняющих эффекторные функции. Несмотря на то, что изучению влияния опиоидных пептидов на пролиферативный ответ уделено достаточно много внимания (Зозуля и др., 1990; Panerai et al., 1997; Sacerdote, 2003), ряд аспектов данной проблемы остается нерешенным. В частности, остается открытым вопрос о механизмах реализации эффектов β-эндорфина, наиболее активного представителя данной группы соединений, способного связываться одновременно с несколькими типами опиатных рецепторов. Предполагается возможность кооперации опиатных рецепторов в проведении сигналов внутрь клетки (Усенко и др., 2002; Sharp et al., 1998). Цель работы – оценить в системе in vitro влияние в -эндорфина на пролиферативный ответ лимфоцитов в условиях блокады опиатных рецепторов неселективным и селективным антагонистами, сравнить эффекты в -эндорфина с эффектами селективных ц - и 5 -агонистов DAGO и DADLE соответственно.

Материалы и методы

Лейкоциты периферической крови 10 здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 20 до 33 лет культивировали с фитогемагглютинином Р (ФГА «Sigma», США; 2.5 мкг/мл) в 96-луночных круглодонных планшетах. Каждая культура содержала 2*10⁵ клеток в 0.2 мл полной питательной среды, которую готовили на основе среды 199 с добавлением HEPES 10 mM («Sigma», США), L-глутамина 2 mM («Sigma», США), 100 мкг/мл гентамицина и 10% аутоплазмы. Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% СО 2 при 37˚С в течение 72 ч. За 18 ч до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи ³H-тимидина («Изотоп», Санкт-Петербург) в объеме 10 мкл. Содержимое каждой лунки последовательно осаждали на фильтровальную бумагу (Фриммель, 1987) при давлении вакуумного насоса 0.5–1.0 атм. Затем фильтры промывали последовательно 5 мл 0.85% NaCl, 5 мл охлажденной до 4˚С 5% трихлоруксусной кислотой и 5 мл 0.85% NaCl. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» (Wallac, Финляндия). в -эндорфин («Sigma», США) использовали в концентрации 10 -7 М; [ d-Ala²,N-Me-Phe⁴,Gly⁵-ol ] -энкефалин (DAGO) («Sigma», США) - 10 -8 М; [ d -Ala 2 ,d-Leu⁵ ] -энкефалин (DADLE) («Sigma», США) – 10^-7 М; неселективный антагонист опиатных рецепторов налоксона гидрохлорид («DuPont», США) – 10^-6, 10^-8, 10^-10М; селективный антагонист δ-опиатных рецепторов налтриндола гидрохлорид («ISN», США)-10^-6,

10^-8, 10^-10М. Выбор концентраций β -эндорфина, DAGO, DADLE и ФГА основывался на исследованиях, проведенных ранее (Гейн и др., 2003; Гейн и др. 2006).

Статистический анализ результатов проводили с помощью парного t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Как представлено на рис. 1, в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл β -эндорфин в концентрации 10^-7М статистически значимо усиливал пролиферативный ответ по сравнению с контролем. При совместном внесении в клеточные культуры β -эндорфина и неселективного блокатора δ-, μ-опиатных рецепторов налоксона гидрохлорида наблюдалось усиле-

Значения, полученные при совместном внесении в культуры селективного δ -антагониста на-лтриндола и β-эндорфина, статистически значимо не отличались от контрольных цифр, что может свидетельствовать об отмене стимулирующего эффекта опиоида δ-блокатором. Сам налтриндол не оказывал влияния на пролиферативную активность лимфоцитов ни в одной из исследуемых концентраций.

Данные о влиянии DAGO в условиях блокады опиатных рецепторов на выраженность РБТЛ представлены на рис. 2. В культурах с ФГА 2,5 мкг/мл DAGO оказывал самостоятельный статистически значимый стимулирующий эффект на пролиферативный ответ по сравнению с контролем. Как и в случае с β -эндорфином, на фоне бло-

Рис. 1. Влияние β -эндорфина ( β -эф) на пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии ФГА 2.5 мкг/мл в условиях блокады опиатных рецепторов налоксона гидрохлоридом (НГ) ( А ) и на-лтриндола гидрохлоридом (НТ) ( Б ). Здесь и на рис. 2, 3: по оси абсцисс – интенсивность пролиферации (имп/мин); * – р<0,05 по сравнению с контролем; • – р<0.05 по сравнению с пептидом

А

Б

Рис. 2. Влияние DAGO на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с ФГА 2.5 мкг/мл в условиях блокады опиатных рецепторов налоксона гидрохлоридом (НГ) ( А ) и налтриндола гидрохлоридом (НТ) ( Б )

ние пролиферации как по сравнению с контролем, так и по сравнению с эффектом изолированного внесения β -эндорфина. Этот феномен имел место при всех используемых нами концентрациях налоксона. Неожиданным оказалось наличие у налоксона самостоятельного стимулирующего влияния на пролиферативную реакцию, чего не наблюдалось у контрольных культур.

кады опиатных рецепторов налоксоном наблюдалось усиление пролиферативной активности лимфоцитов как по сравнению с таковой у контрольных культур, так и у культур при изолированном внесении DAGO. В данной серии экспериментов мы подтвердили самостоятельный стимулирующий эффект налоксона в концентрации 10-6М на пролиферативный ответ лимфоцитов.

В присутствии налтриндола была получена картина, аналогичная таковой в культурах с β-эндорфином. Внесение δ-селективного антагониста в культуры с DAGO отменяло стимулирующий эффект опиоидного пептида. Таким образом, селективный агонист µ-рецепторов оказывал эффект, схожий по своему характеру с эффектом β-эндорфина, при этом для проявления эффектов как β-эндорфина, так и селективного μ-агониста оказалось необходимым присутствие на клетках δ- опиатных рецепторов.

Сходное по характеру, но более слабое по силе воздействие на пролиферативную реакцию было выявлено у синтетического δ-агониста DADLE. Как показано на рис. 3, блокада опиатных рецепторов налоксоном совместно с δ-агонистом в культурах с ФГА 2.5 мкг/мл также значимо усиливала эффект самого агониста. В то же время внесение в культуры с DADLE δ-антагониста не изменяло выраженности пролиферативного ответа лимфоцитов по сравнению с таковой у культур, в которые вносился лишь DADLE, что еще раз подтверждает способ- ность антагонистов опиатных рецепторов при опре-

Оценка зависимости влияния β -эндорфина, DAGO и DADLE от блокады опиатных рецепторов показала усиление стимулирующих эффектов исследуемых опиоидных пептидов в присутствии налоксона гидрохлорида. С одной стороны, данный феномен может быть связан с наличием у налоксона самостоятельного стимулирующего эффекта на процесс пролиферации лимфоцитов. В работах некоторых авторов ранее уже были отмечены самостоятельные стимулирующие эффекты блокаторов опиатных рeцепторов в системе in vivo, однако авторы связывали их с отменой угнетающих эффектов эндогенной опиоидной системы (Manfredi et al., 1993). В нашем случае, вероятнее всего, имеет место суммация эффектов β-эндорфина и налоксона, возможная благодаря наличию в пределах µ -опиатных рецепторов различных доменов связывания для опиатных алкалоидов, β-эндорфина и других опиоидных пептидов, в частности, энкефалинов и их аналогов (Law, 1999). По данным литературы, наибольшая аффинность (специфичность) наблюдается у налоксона именно по отношению к μ-опиатному рецептору (Сергеев

А

Б

Рис. 3. Влияние DADLE на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с ФГА 2.5 мкг/мл в условиях блокады опиатных рецепторов налоксона гидрохлоридом (НГ) ( А ) и налтриндола гидрохлоридом (НТ) ( Б )

деленных условиях выступать в роли агонистов.

Ранее в литературе неоднократно описывалась возможность как супрессивного, так и активирующего влияния β -эндорфина на выраженность пролиферативного ответа лимфоцитов (Зозуля и др., 1986, 1987, 1990; Manfredi et al., 1993; Гейн и др., 2003). На наш взгляд, стимулирующая направленность эффекта β -эндорфина определяется прежде всего его способностью оказывать как прямое (через стимуляцию µ -, δ -, ε -опиатных рецепторов), так и опосредованное воздействие. Последнее может включать в себя активацию синтеза отдельных цитокинов: интерлейкина 1 (ИЛ-1), интерферона γ (ИФН-γ), интерлейкина 2 (ИЛ-2) (Brown et al., 1986; Bessler et al., 1990; Shahabi et al., 1995), возможное взаимодействие с рецептором к ИЛ-2 (Carr D.J. et al., 1991; Jiang et al., 2000). Определенную роль в воздействии β -эндорфина на клетки иммунной системы могут играть продукты его протеолиза, каждый из которых может обладать собственной иммуномодулирующей активностью (Захарова и др., 2001).

и др., 1987; Sacerdote, 2003). По другим данным, его аффинность приблизительно одинакова в отношении как µ -, так и δ -опиатных рецепторов (Law, 1999). Аналогичными свойствами обладает β -эндорфин (Зозуля и др., 1990).

В последние годы появилось предположение, что подтипов опиатных рецепторов с физикохимической точки зрения не существует, а есть явления гомо-, гетеро- и олигомеризации δ- и μ-опиатных рецепторов (Law, 1999). В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные, полученные нами при совместном внесении в культуры β-эндорфина и налтриндола гидрохлорида.

Несмотря на сходство эффектов DAGO и β-эндорфина, действие последнего было выражено значительно сильнее. Различие в выраженности эффектов, на наш взгляд, может быть связано с наличием разных сайтов связывания этих пептидов в пределах μ-опиатного рецептора, а также со способностью β -эндорфина взаимодействовать дополнительно с δ - и ε -рецепторами.

Таким образом, полученные в настоящей работе данные указывают на то, что опиоидергическая регуляция пролиферативной активности является сложным многофакторным процессом, в котором как агонисты, так и антагонисты опиатных рецепторов способны проявлять самостоятельные, независимые друг от друга эффекты.

Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН № 10 «Физико-химическая биология» (академик Г.П. Георгиев) – Грант «Молекулярные и клеточные механизмы нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы при стрессе».