Бактериальные сообщества цианосферы монокультур цианобактерий из пресных озер Котокель и Дикое (Бурятия, Россия)

Активное развитие цианобактерий представляет собой серьезную экологическую проблему и угрожает устойчивости пресноводных экосистем. Интенсивность и частота данного явления возрастают под воздействием изменений климата и антропогенной эвтрофикации [Sukenik et al., 2015; Woodhouse et al., 2018]. В 2008 г. на озере Котокель произошла экологическая катастрофа — началась массовая гибель рыб, зафиксированы случаи заболевания местного населения, диагностируемого как гаффская болезнь. В итоге водоем потерял рыбохозяйственное и рекреационное значение [Озеро Котокельское... 2013]. Здесь были выявлены токсичные виды цианобактерий Microcystis aeruginosa и Anabaena sp., содержащие гены микроцистин — синтазы [Белых и др., 2015].

Факторы и процессы, способствующие цветению цианобактерий в эвтрофных пресноводных экосистемах, широко изучаются. Все больше исследований последних лет посвящено прямому или косвенному взаимодействию между цианобактериями и гетеротрофными бактериями. Присутствие бактерий, непосредственно прикрепленных или непосредственно прилегающих к клеткам цианобактерий, предполагает интенсивный обмен питательными веществами между этими микроорганизмами [Louati et al., 2016]. Изучение микробных сообществ «цианосферы», присутствующих в узкой зоне, прилегающей к клеткам цианобактерий, является важным для понимания развития фитопланктона и процессов, происходящих в водной среде [Cai et al., 2014]. Целью настоящего исследования является сравнение таксономического разнообразия бактериальных сообществ в монокультурах цианобактерий, выделенных из озер Котокель и Дикое методом высокопроизводительного секвенирования.

Материал и методы

Образцы проб (микробные биопленки) для выделений монокультур цианобактерий были отобраны летом 2021 г. из прибрежной зоны озер Котокель и Дикое (Прибайкальский район, Республика Бурятия, Россия). Выделение цианобактерий проводили методом пересевов накопительных культур на жидкие и агаризованные среды «Z8» [Kótai, 1972]. Культивирование цианобактерий проводили в условиях люминостата при температуре 20–25 °С. Освещенность на поверхности суспензии культур составляла 2 000 лк. Микроскопирование проб осуществляли при помощи светового микроскопа «Carl Zeiss» (Axiostar Plus, Германия).

Профилирование бактериального сообщества цианобактериальных культур по гену 16S рРНК проводилось с использованием оборудования ЦКП ГТПиКБ ФГБНУ ВНИИСХМ (г. Санкт-Петербург, Россия). Очищенные препараты ДНК образцов были использованы для создания библиотек фрагментов гена 16S рРНК методом ПЦР с использованием универсальных праймеров для вариабельной области V4: F515/R806 (GTGCCAGCMGCCGGCGGTAA/ GGACTACVSGGGTATCTAAT).

Подготовка библиотеки и секвенирование проводились в соответствии с рекомендациями производителя по эксплуатации прибора Illumina MiSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США) с использованием MiSeq® ReagentKit v3 (600 циклов) в парном цикле (2×300 н). Для таксономической классификации полученных операционных таксономических единиц (ОТЕ) использовались программные пакеты DADA2, PHYLOSEQ и SILVA. Полученные последовательности депонированы в GenBank под номерами PRJNA1372452, PRJNA1372465 и PRJNA1372846.

Результаты и обсуждение

Из трех образцов было получено 62 772 прочтения по вариабельной области V4 гена 16S рРНК, включая неклассифицированные ОТЕ, которые были использованы в анализе. Монокультуры цианобактерий были представлены тремя видами гетероцистных цианобактерий, относящимися к родам Nostoc и Calothrix семейства Nostocaceae (озеро Котокель) и Tychonema семейства Phormidiaceae (озеро Дикое). Большинство бактериальных последовательностей цианосферы принадлежало пяти основным типам: Bacteroidota, Pseudomonadota, Actinobacteriota, Bacillota и Verrucomicrobiota . Эти основные группы различались по относительному обилию среди образцов (таблица).

Среди ассоциированных с цианобактерией Nostoc бактерий доминировали представители филума Pseudomonadota (92,2 %). Среди них доминировали представители рода Phreatobacter семейства Rhizobiales Incertae Sedis (43 %), в два раза меньше были представлены бактерии семейства Rhizobiaceae (20,1 %). Также в сообществе были представлены семейства Comamonadaceae и Solimonadaceae. В бактериальном сообществе Nostoc встречались бактерии филума Verrucomicrobiota , содержание которых составляет 5,6%. Они были представлены неклассифицированными бактериями рода Neochlamydia семейства Parachlamydiaceae .

В цианосфере монокультуры Calothrix были выявлены гетеротрофные бактерии, относящиеся к филумам Pseudomonadota (36,5 % общего количества), Actinobacteriota (32 %), Bacillota (21,2 %) и Bacteroidota (7,2 %). Популяция бактерий Pseudomonadota состояла из Alphaproteobacteria , среди которых доминировали неклассифицированные бактерии рода Brevundimonas (семейство Caulobacter-aceae ) (23,4 %) и неклассифицированные бактерии класса Alphaproteobacteria (8,7 %). Также в культуре встречались представители семейств Sphingomonada-ceae и Acetobacteraceae . Среди бактерий филума Actinobacteriota доминировали неклассифицированные бактерии рода Microbacterium семейства Microbacteria-ceae (22,3 %) и рода Blastococcus семейства Geodermatophilaceae (6,5 %). Также были обнаружены представители семейств Micrococcaceae и Nocardioidaceae . Бактерии филума Bacillota были представлены unclassified_ Bacillales (21,2 %), бактерии филума Bacteroidota — unclassified_ Pontibacter (7,2 %).

В цианосфере монокультуры Tychonema популяция бактерий филума Pseudo-monadota была представлена бактериями рода Paracoccus (9,2%) и рода Rhodobac-teraceae (8,3%). Были выявлены гетеротрофные бактерии, относящиеся к филуму Bacteroidota , которые составляли половину сообщества (49,6%) и относились к семейству Flavobacteriaceae . Также обнаружены бактерии филумов Actinobacteriota (32,2%) и Pseudomonadota (17,7%). Актинобактерии состояли в основном из неклассифицированных бактерий родов Microbacterium (семейство Microbacte-riaceae ) и Blastococcus (семейство Geodermatophilaceae ). Бактерии филума Pseu-domonadota относились к классу Alphaproteobacteria , семейству Rhodobacteraceae , роду Paracoccus.

Среди спутников цианобактерий Tychonema, Nostoc и Calothrix были выявлены неклассифицированные прокариоты в количестве 0,3 %, 2,2 % и 3 % соответственно. Pseudomonadota был наиболее распространенным филумом бактерий в гетеротрофном сообществе всех трех монокультур цианобактерий (17,7–92,2 %) при доминировании класса Alphaproteobacteria , что позволяет предположить, что этот филум хорошо приспособлен к заселению цианосферы. Представители филума Bacteroidota доминировали в монокультуре цианобактерии Tychonema (49,6 %) и выявлены в монокультуре цианобактерии Nostoc. Бактерии филума Actinobacteriota, которые, как правило, встречаются в изобилии в пресноводных экосистемах, также были широко представлены в монокультурах. Это согласуется с другими исследованиями [Cai et al., 2014] и указывает на то, что представители этих групп, по-видимому, адаптированы к условиям цветения, скорее всего, в результате их способности разлагать сложные макромолекулы и метаболиты, выделяемые цианобактериями. Филум Bacillota был широко распространен только в монокультуре цианобактерии Calothrix. Относительная доля Verrucomi-crobiota достигала 5,6 % в монокультуре Nostoc. Известно, что этот филум распространен в богатых питательными веществами средах и связан с цветением водорослей. Ранее нами показано, что в периоды цветения основными доминирующими филумами бактериями в фитопланктоне озер Котокель и Дикое были Cyanobacteriota, Pseudomonadota, Actinobacteriota, Bacteroidota, Verrucomicrobiota и Bacillota и их соотношение менялось в разные годы [Цыренова и др., 2023].

Таким образом, с помощью высокопроизводительного секвенирования впервые был охарактеризован состав бактериального сообщества цианосферы у трех монокультур цианобактерий родов Nostoc , Calothrix и Tychonema , выделенных из пресных озер Котокель и Дикое, которые подвержены эвтрофикации. Большинство последовательностей гетеротрофных бактерий различалось по относительному обилию в разных монокультурах цианобактерий. В бактериальном сообществе цианосферы Nostoc доминировали неклассифицированные бактерии рода Phreatobacter , в монокультуре Calothrix неклассифицированные бактерии родов Brevundimonas, Microbacterium и порядка Bacillales, в монокультуре Tychonema — неклассифицированные бактерии родов Flavobacterium и Microbacterium. Это исследование будет способствовать современному пониманию взаимодействия и экологической роли автотрофных и гетеротрофных бактериальных сообществ в водных экосистемах.