Бактеризация семян Medicago sativa L. и Cynodon dactylon (L.) Pers. при проведении процесса фиторемедиации нефтезагрязненных почв

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

В последние десятилетия в результате увеличения добычи, транспортировки, переработки и использования нефти и нефтепродуктов сильно возросли степень и масштабность загрязнения окружающих ландшафтов нефтью и нефтепродуктами. Наиболее интенсивно подвергается загрязнению этими веществами почвенный покров. Особенно остра проблема загрязнения земель нефтью и нефтепродуктами в Азербайджане, на Апшеронском полуострове. Площадь территории полуострова составляет 222 тыс га, из них на долю нефтепромыслов — 30 тыс га, или 13,5% [1].

Процесс аккумуляции нефтяных углеводородов в почве приводит к изменению их физико-химических свойств, развитию фитотоксичности почвенного покрова. Это приводит к подавлению роста и развития высших растений или же к их полному угнетению [2–4].

Рекультивация нефтезагрязненных серо-бурых почв на Апшеронском полуострове является для данного региона одной из важнейших проблем экологии. Ранее были проведены работы по экологической оценке техногеннозагрязненных земель [5], проблеме очистки и повышения плодородия нефтезагрязненных почв региона [6], экологическим критериям выбора технологий очистки нефтезагрязненных почв [7], роли нефтеокисляющих микроорганизмов в очистке нефтезагрязненных почв, разработке методов очистки и результатах использования методов биоремедиации на Апшеронском полуострове [8–10], устойчивости свинороя ( Cynodon dactylon ) к загрязнению почв нефтяными углеводородами.

Одним из путей ремедиации почв, загрязненных нефтяными углеводородами, является использование методов фиторемедиации. По сравнению с другими способами ремедиации загрязненных нефтяными углеводородами почв, фиторемедиация является экологически безопасной и экономичной [11–14].

Фиторемедиация нефтезагрязненных почв на сегодняшний день одна из эффективных экотехнологий, с помощью которых можно решать проблемы очистки почв, загрязненных органическими и неорганическими веществами, в том числе нефтью и нефтепродуктами [15– 18].

Известна способность растений разных видов осуществлять детоксикацию нефтяных углеводородов [19].

Один из перспективных способов решения проблемы загрязнения почв нефтяными углеводородами — разработка методов и подходов их очистки и детоксикации in situ , и прежде всего, биодетоксикации и биоремедиации. Для очистки почв, загрязненных углеводородами, развивают технологии био- и фиторемедиации с участием растений и микроорганизмов [20–23].

Наиболее привлекательны методы, в основе которых лежит совместное использование природных ассоциаций высших растений и микроорганизмов. Имеется работа по использованию метода бактеризации семян различных растений с помощью микробных культур Sinorhizobium meliloti P221 или Azospirillum brasilense SR8023. Показано, что в загрязнённом грунте ризосферные микробные ассоциации способствуют выживанию растений за счёт выделения ряда поддерживающих рост веществ, а также постепенному снижению загрязняющих веществ в результате микробного разложения. В этой связи интерес представляют микробные биопрепараты, с одной стороны стимулирующие рост растений, с другой — обладающие способностью с высокой скоростью разлагать органический загрязнитель [24].

Практическое и технологическое значение использования этих подходов особенно эффективно на стадиях, когда ставится задача доочистить почвенный покров от остаточных нефтепродуктов после их предварительной очистки физико-химическими или другими методами, а также на поздних стадиях биоочистки, когда легкие фракции уже разложились, а в почве остаются высокомолекулярные компоненты: смолы, асфальтены, полиароматические соединения и др., трудно разлагаемые почвенными микроорганизмами. Исследования ряда авторов также подтверждают возможность создания высокопродуктивных растительномикробных систем с использованием полезных микроорганизмов в биотехнологиях [25–28].

Целью работы является исследование эффективности использования растительномикробных систем на основе региональных биоресурсов для ремедиации нефтезагрязненных серо-бурых почв.

Объекты и методы

С использованием комплексных систем из растений и микроорганизмов в лабораторных условиях исследовали фиторемедиацию почвы, загрязненной сырой нефтью в концентрации 15 г/кг. Использовали семена люцерны ( Medicago sativa L.) и свинороя пальчатого ( Cynodon dactylon (L.) Pers.).

Люцерна посевная относится к роду многолетних трав семейства бобовых. Растение люцерны отлично адаптируется к различным условиям выращивания и погодным условиям, может быть очень устойчиво к засухе. Также, в нем содержатся симбиотические почвенные бактерии в корневых узлах, которые «фиксируют» азот из воздуха в почву и является естественным источником азота. Так как он улучшает физико-химические и биологические свойства почвы, его удобно использовать в процессах рекультивации.

Свинорой пальчатый обычно встречается на различных почвах, но предпочитает сухие, теплые места. Это одна из самых устойчивых злаковых культур к загрязнению почв углеводородами, преобладает на серо-бурых почвах Апшеронского полуострова [7].

Эксперименты ставили в вегетационных сосудах. Использовали семена растений в соотношении 1:1 (по весу). В экспериментах использовали методы бактеризации семян растений биопрепаратом «Ферми-старт» и его модифицированным вариантом. Биопрепарат «Ферми-старт» производится в Азербайджане фирмой «АгроБиоТех». Состав биопрепарата «Ферми-старт» включал ассоциацию эффективных микроорганизмов (молочнокислые, азотфиксирующие бактерии, дрожжи, грибы и актиномицеты), содержание КОЕ — 1×10. Модифицирование биопрепарата «Ферми-старт» состоял во введение в его состав культуры нефтеокисляющего микроорганизма Pseudomonas aeruginosa штамм №3, выделенного из нефтезагрязненной серо-бурой почвы ( Qypisic calcisols soils. ) Апшеронского полуострова и способного использовать нефтяные углеводороды [3].

Предварительные исследования показали, что этот штамм в процессе культивирования в жидкой минеральной среде Раймонда разлагал сырую нефть в концентрации 10–15 г/л за 10 сут на 71–77%. Смысл модификации состоял в расширении функциональной способности биопрепарата «Ферми-старт», а именно, наряду с основной функцией повышения биологической активности почв придать ему дополнительную функцию — участвовать в процессе разложения нефтяных углеводородов в загрязнённой нефтью почве.

Перед посевом семена растений стерилизовали с использованием тепловой обработки при t=52–60°С в течение 30–40 минут с последующей опусканием их в воду при комнатной температуре. Затем стерильные семена люцерны и свинороя обрабатывали модифицированным микробным препаратом «Ферми-старт».

Готовили рабочий раствор модифицированного препарата «Ферми-старт» с водой 1:10 и обрабатывали семена в день посева. Бактеризацию проводили путем погружения семян в микробную суспензию в течение 2–3 ч. Титр микроорганизмов в суспензии составлял 1– 3×109 клеток/мл. Исследовали процесс фиторемедиации серо-бурой почвы, загрязнённой сырой нефтью в концентрации 15,0 г/кг в вегетационных сосудах в различных вариантах. Осуществляли посев семян исследуемых растений в вегетационные сосуды как в отдельности, так и в соотношении 1:1.

В другой серии опытов проводили вегетационные опыты с использованием биосистемы «растение + биопрепарат «Ферми-старт» (вариант 3), также растение + нефть + культура P. aeruginosa (вариант 4). Другая серия экспериментов состояла в использовании биопрепарата «Ферми-старт», модифицированного штаммом нефтеокисляющей культуры P. aeruginosa штамм №3 (вариант 5).

Предварительно откалиброванные семена люцерны и свинороя после стерилизации сеяли по 20 семян в 1 л сосуды, содержащие 1,0 кг серо-бурой почвы. Бактеризацию почвы модифицированным биопрепаратом проводили, поливая 5-дневные всходы растений суспензией микробного биопрепарата до достижения концентрации микроорганизма в почве 1×107 КОЕ/1 г почвы. Растения выращивали в помещении с температурой 20–24°С и относительной влажностью воздуха 65%. Влажность почвы поддерживали на уровне 50–60% от полевой влагоемкости.

Необходимость полива определяли взвешиванием сосудов. Анализ растений включал в себя определение всхожести, энергии (скорости) прорастания семян, приживаемости растений, измерение побегов по длине через 8–12 дней начала эксперимента. Остаточное содержание сырой нефти в почве во всех вариантах проводили через 8, 12, 30 и 90 дней после начала эксперимента, биомониторинг роста и развития растений определяли на 8–12 день.

Для извлечения нефтяных углеводородов из почв использована методика согласно EPA method 3540. Сущность метода заключается в непрерывной экстракции до полного извлечения нефтепродукта из загрязненного образца органическими растворителями (смесь гексан: хлороформ в соотношении 1:1) в аппарате Сокслета, выпаривании растворителя, остаток взвешивают. Содержание основной массы остаточных нефтепродуктов и их окисленных соединений в мг/100 г почвы находили по формуле:

x 2

( m_{ — m ₂ )100

где m 1 — масса бюкса с остатком после удаления экстрагента, мг; m 2 — масса пустого бюкса, мг; 10 — вес пробы, взятой для определения, в г. Все эксперименты и анализы проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью статистического пакета Excel (MS Office 2007).

Результаты и обсуждение

Изучение взаимодействия штаммов-деструкторов углеводородов нефти и биопрепарата «Ферми-старт» проводили в модельных системах. Было показано, что сырая нефть в концентрации 1,5% оказывает значительный фитотоксический эффект на побеги люцерны (длина побегов снижалась на 73% по сравнению с положительным контролем) (Рисунок 1).

Варианты Options

Рисунок 1. Высота побега люцерны через 8 дней культивирования: 1 — растение; 2 — растение + нефть; 3 — растение + нефть + «Ферми-старт»; 4 — растение + нефть + культура P. aeruginosa ; 5 — растение + нефть + модифицированный биопрепарат («Ферми-страт» + P. aeruginosa )

Внесение модифицированного биопрепарата «Ферми-старт», а также культуры P. aeruginosa оказывало защитный эффект от воздействия сырой нефти на проростки люцерны. Наибольший защитный эффект от воздействия сырой нефти на проростки люцерны оказывало совместное внесение биопрепарата «Ферми-старт» и культуры P. aeruginosa (Рисунок 1). В результате через 8 дней высота побегов возрастала на 71% по сравнению с отрицательным контролем (растения с нефтью). Полагаем, что при использовании штамма P. aeruginosa должно происходить ускорение потребления нефти [8], однако, в системе остаточная концентрация нефти (0,137 мг/г почвы) была выше, чем в случае, когда использовались система P. aeruginosa + «Ферми-старт» (Рисунок 2).

Options

Рисунок 2. Остаточное содержание углеводородов в модельных системах через 8 суток культивирования люцерны: 1 — растение; 2 — растение + нефть; 3 — растение + нефть + «Ферми-старт»; 4 — растение + нефть+ культура P. aeruginosa ; 5 — растение + нефть +модифицированный биопрепарат «Ферми-старт»

Так как при интродукции нефтеокисляющего микроорганизма деградация нефти составила 18% (Рисунок 2), а защитный эффект на растения был незначительным (Рисунок 1), предполагается, что этот микроорганизм в процессе деградации нефти накапливает неизвестное соединение, которое, возможно, является токсичным для растений. А при совместном культивировании «Ферми-старт» и нефтеокисляющей культуры микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата, возможно способны потреблять накопленный P. aeruginosa интермедиат, снимая тем самым токсический эффект, параллельно повышая степень деградации нефти до 24%.

Внесение модифицированного биопрепарата «Ферми-старт» в серо-бурую почву, загрязнённую нефтью и засеянные растениями (свинорой и люцерна), способствовало детоксикации почвы, что отражалось на длине побега по сравнению с отрицательным контролем (растения + нефть) (Рисунок 3). Можно полагать, что это связано со способностью микроорганизмов колонизировать корни растений и ризосферу, снижая тем самым токсический эффект нефти за счет своей деградативной активности. Это подтверждается данными, которые показывают, что численность микроорганизмов в ризоплане растений была выше на 1–2 порядка (в среднем около 1,1×107), чем в ризосфере (в среднем около 1,4×105), что может быть связано с выделением корневых экссудатов растений. Люцерна значительно стимулировала численность ризосферных микроорганизмов, способных к деградации углеводородов. Данные по степени разложения нефти в модельных системах оценивали через 12 суток эксперимента (Рисунок 4).

Как видно на Рисунке 4, наибольшую деградацию нефти в серо-бурой почве — соответственно на 16,0% и 17,9% за 12 дней наблюдали в системе растение +модифицированный биопрепарат. В системе свинорой + модифицированный биопрепарат наблюдали более высокую степень деградации нефти в серо-бурой почве (около 17,9%) по сравнению со всеми другими вариантами эксперимента. В загрязненной сырой нефтью почве бактеризация семян растений биопрепаратом «Ферми-старт» повышала устойчивость люцерны и свинороя соответственно на 12% и 15%, увеличивала прирост биомассы их корней и побегов по сравнению с небактеризованным вариантом на 13% и 24% соответственно.

Options

Рисунок 3. Высота побега растений (люцерна и свинорой) в модельном эксперименте через 12 дней культивирования: 1 — люцерна; 2 — свинорой; 3 — люцерна + нефть; 4 — свинорой + нефть; 5 — люцерна + модифицированный биопрепарат «Ферми-старт; 6 — свинорой + модифицированный биопрепарат «Ферми-старт»

Рисунок 4. Степень деградации нефти в модельных почвенных системах с растительномикробными ассоциациями (12 суток): 1 — нефть + модифицированный препарат; 2 — нефть + люцерна; 3 — нефть + свинорой; 4 — нефть + люцерна + биопрепарат; 5 — нефть + свинорой + биопрепарат

Бактеризация увеличивала прирост биомассы корней люцерны по сравнению с небактеризованным вариантом на 9% — в чистом грунте и на 18% — в загрязненном. В грунте, загрязненном сырой нефтью, надземная биомасса люцерны была на 29% больше у бактеризованных растений по сравнению с не бактеризованными.

Химический анализ показал, что содержание сырой нефти в почве с не бактеризованными растениями ( Medicago sativa, Cynodon dactylon ) через 90 дней культивирования снизилось на 59%, а с бактеризованным биопрепаратом «Ферми-старт» — на 78%, деградация углеводородов в почве под свинороем и люцерной составила 67% соответственно, что на 25–45% было больше по сравнению с контролем.

Таким образом, консорциум, модифицированный «Ферми-старт», ассоциированный с растениями — свинороем пальчатым и люцерной является эффективной биосистемой для ремедиации нефтезагрязненных серо-бурых почв, так как внутри ассоциации отсутствуют отрицательные взаимодействия, влияющие на скорость и эффективность утилизации нефти, численность микроорганизмов и развитие растений, ассоциированных со штаммом-деструктором. По-видимому, свинорой в сочетании с люцерной образовывали эффективную для фиторемедиации травосмесь. Установлено, что инокуляция растений модифицированным биопрепаратом «Ферми-старт» влияет на численность ризосферных микроорганизмов, которые стимулируют рост растений, также на степень очистки серо-бурой почвы от углеводородов.

Изученная культура углеводородокисляющих бактерий вида P. aeruginosa штамм №3, является потенциальным инокулянтом для модификации биопрепарата «Ферми-старт» из группы «эффективных микроорганизмов», а сам модифицированный биопрепарат является потенциальным инокулятором растений свинороя и люцерны для улучшения их роста и повышения эффективности фиторемедиации загрязнённых углеводородами серо-бурой почвы Апшеронского полуострова при остаточной степени загрязнения 1,0–1,5%. Штамм рода P. aeruginosa №3 может быть использован в качестве интродуцента в микробный биопрепарат «Ферми-старт» для придания ему полифункциональности и для очистки и доочистки серо-бурой почвы, загрязнённой нефтепродуктами и предварительно очищенной от основной части углеводородов. Свинорой пальчатый представляет собой засухоустойчивое и солестойкое зерновое растение, в этой связи совместно с бобовыми, в том числе люцерной, этот вид, широко распространённый в регионе и наиболее устойчивый к загрязнению почв нефтяными углеводородами, может иметь большую перспективу для создания растительномикробных систем при разработке технологий биоремедиации серо-бурых почв Апшерона.

Известно, что корневища свинороя содержат углеводы (сахарозу, фруктаны), органические кислоты и их производные (соли яблочной кислоты), каротиноиды (р-каротин, феофитин А и В, неоксантин, виолаксантин, зеаксантин, лютеин, эфир лютеина), витамин В, жирное масло [29]. Это способствует созданию оптимальных условий для жизнедеятельности микроорганизмов, которые составляют основу биопрепаратов «Ферми-старт», модифицированных культурами нефтеокисляющих микроорганизмов. Что касается люцерны, то почти половина всей массы тонких корней у люцерны осенью отмирает и разлагается. Это способствует накоплению гумуса, а корневая система люцерны достигает глубины 50–170 см, при этом основная масса корней занимает слой почвы до 100 см [30]. Это свидетельствует о том, что корневища биосистемы люцерна + свинорой совместно с ассоциированными на них в зоне ризосферы микроорганизмами будут охватывать значительный по площади и глубине слой загрязнённой нефтяными углеводородами серобурой почвы, где будут протекать процессы деградации загрязнителей и тем самым создавать благоприятную среду для поступления атмосферного кислорода в почву, что в свою очередь будет иметь положительное воздействие на функционирование нефтеокисляющих микроорганизмов, как аборигенных, так и внесенных в составе модифицированного биопрепарата «Ферми-старт», ускоряя процесс ремедиации.

Таким образом, анализ различных приёмов, направленных на повышение эффективности фиторемедиации серо-бурой почвы от углеводородного загрязнения, показала перспективность использования бобово-злаковой травосмеси, бактеризации растений, стимулирующими их рост штаммом-деструктором углеводородов P. aeruginosa. Выявлена принципиальная роль биосистемы люцерны и свинороя как компонентов травосмесей, стимулирующей почвенную микрофлору и, наконец, усиливающей очистку почвы от остатков нефти. Результаты исследований позволяют рекомендовать использование растительно-микробной биосистемы, состоящей из люцерны + свинорой совместно с модифицированным культурой нефтеокисляющего микроорганизма Pseudomonas aeruginosa биопрепаратом «Ферми-старт» для фиторемедиации серо-бурой почвы Апшеронского полуострова, загрязненной сырой нефтью.