Белковая компенсация кровопотери при использовании направленного транспорта аскорбиновой кислоты в печень

Введение. Печень занимает центральное место в белковом обмене. Ей принадлежит важная роль в обеспечении белками других органов и тканей, в частности сыворотки крови [5]. Кровопотеря довольно рано отражается на белковом метаболизме. Изменения азотистого обмена обусловлены плазмопоте-рей, перестройкой метаболизма в связи с новым уровнем гормональной регуляции функций органов и систем, изменением соотношения анаболических и катаболических процессов, новыми условиями энергетического обеспечения функций [17].

Можно выделить роль двух основных факторов противоположной направленности при кровопотере: гипоксии, угнетающей синтез белка, и потери белков, стимулирующей этот процесс. От преобладания того или иного механизма зависит преобладание анаболических или катаболических реакций [7]. Поэтому имеющиеся данные о влиянии кровопотери на синтез белков плазмы и печени противоречивы. Так, скорость включения меченых аминокислот в белки плазмы и печени животных после кровопускания, по данным одних авторов, не изменялась [25], а по данным других – увеличивалась [13] или, напротив, уменьшалась [8].

Восстановление белкового состава крови (вследствие синтеза в печени) – реакция белковой компенсации кровопотери [23].

В условиях кровопотери особенно важна нормализация коллоидно-осмотического давления, позволяющая сохранить соответствующий объем плазмы крови и уровень обмена жидкости в микроциркуляторном русле. Коллоидно-осмотическое давление обусловлено в основном низкомолекулярными белками плазмы крови – альбуминами, содержание которых зависит от функциональной активности печени [9, 10].

Не менее важным является сохранение в условиях кровопотери фракции β-глобули-нов, к числу которых относятся такие белки, как трансферрин, гемопексин, белки свертывающей и антисвертывающей систем, белки, транспортирующие витамин В 12 , и др. Сохранение синтеза данных белков будет препятствовать развитию анемического синдрома в условиях кровопотери.

Поэтому с целью коррекции функционального состояния печени в условиях кровопотери необходимо использовать вещества, предотвращающие развитие гипоксии в органе, а также ускоряющие нормализацию функций гепатоцитов в постгипоксический период. В качестве такого вещества нами выбрана аскорбиновая кислота (АК) – поли-функциональное вещество с исключительно широким спектром антигипоксического действия [15]. Мы предположили, что АК повысит уровень устойчивости и адаптации печени к кровопотере.

Одной из ведущих тенденций, проявляющихся в современной фармакологии, является создание систем направленного транспорта лекарств, это позволяет концентрировать лекарственный препарат в зоне, охваченной патологическим процессом, устранить сам процесс и его негативные последствия [16, 18, 21]. С позиций экстракорпоральной фармакотерапии наиболее целесообразно применять эритроциты при патологических процессах в органах, богатых эритрофагоцитирующими клетками. К таким органам относится печень [16, 18].

Традиционная инфузионно-трансфузионная программа восполнения кровопотери, основанная на применении коллоидных и кристаллоидных кровезамещающих растворов, имеет риск возникновения посттрансфузионных реакций (пирогенных, аллергических) и осложнений [2].

Цель исследования. Оценить эффективность использования аутологичных клеток крови для адресной доставки в печень АК для оптимизации белковой компенсации кровопотери.

Материалы и методы. Исследование проведено на белых беспородных крысах массой 240–280 г. Гипоксию вызывали кровопусканием через катетер [24]. Объем кровопотери составил 2 % от массы животного. Животные были разделены на следующие группы: 1-я группа – интактные животные; 2-я группа – крысы с кровопотерей (материал для исследования брали через 6 и 24 ч после кровопотери); 3-я группа – контрольная – интактные крысы, получавшие АК путем направленного транспорта; 4-я группа – живот- ные с кровопотерей, получавшие АК путем направленного транспорта. Получение эритроцитарных контейнеров (ЭК) с АК производилось методом гипотонического лизиса в модификации Т.П. Генинг [6]. ЭК с АК вводили внутривенно в дозах 25, 50 и 100 мг/кг однократно через 10 мин после кровопотери.

Общее содержание белка в сыворотке крови определяли унифицированным методом по биуретовой реакции [11]; процентное содержание альбуминов и β-глобулинов в сыворотке крови – методом электрофореза на геле агарозы на аппарате Paragon фирмы Bechmen (США). Оценку электрофореграмм проводили с помощью денситометра. Статистическую обработку полученных данных осуществляли по t-критерию Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Экспериментальные исследования проводились с соблюдением биоэтических правил.

Результаты и обсуждение. Из данных нашего исследования, представленных в табл. 1, видно, что содержание общего белка в сыворотке крови крыс через 6 ч после кровопотери достоверно снижается на 13,11 % (с 70,8±4,56 до 61,52±4,41 г/л), а через 24 ч уже имеет тенденцию к нормализации.

Снижение белоксинтезирующей способности печени может быть вызвано несколькими причинами. В результате перераспределения органного кровотока кровоснабжение, в частности, печени по ее микроваскулярно-му руслу ограничивается, в т.ч. за счет арте-риоло-венулярного шунтирования. В результате в органе развивается вторичная тканевая гипоксия, уменьшаются энергетические ресурсы клетки, что приводит к разнообразным расстройствам функций печени [12, 14, 15].

Одним из ведущих патогенетических механизмов развития поражений печени при кровопотере является активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [1, 3]. Образовавшиеся в процессе развития ПОЛ диеновые конъюгаты и малоновый диальдегид в больших концентрациях обладают выраженной цитотоксичностью, тем самым подавляют процессы гликолиза и окислительного фосфорилирования, ингибируют синтез белка, подавляют активность цитозольных и мембраносвязанных ферментов [19].

Содержание общего белка, альбуминов и β-глобулинов в сыворотке крови белых крыс в условиях кровопотери (М±m, n=12)

Таблица 1

Показатель	Условия эксперимента
	Интактные животные	6 ч после кровопотери	24 ч после кровопотери
Общий белок, г/л	70,8±4,56	61,52±4,41*	66,44±4,41
Альбумины, %	47,53±4,50	52,24±6,71	49,96±6,82
β-глобулины, %	6,33±0,51	25,49±3.41*	25,20±2,94*

Примечание. * – достоверность различий по сравнению с интактными животными (р<0,05).

На обоих сроках исследования прослеживается тенденция к увеличению содержания альбуминов в сыворотке крови по сравнению с их содержанием в сыворотке крови интактных крыс.

В то же время содержание β-глобулинов достоверно увеличивается: через 6 ч после кровопотери – в 4,03 раза (с 6,33±0,51 до 25,49±3,41 %), через 24 ч – в 3,98 раза (с 6,33±0,51 до 25,20±2,94 %).

Из табл. 2 видно, что введение АК интактным животным в дозе 25 мг/кг (контроль) не вызывает достоверного изменения содержания общего белка в сыворотке крови по сравнению с показателями нормы.

Однократное введение АК через 6 ч после кровопотери привело к достоверному повышению общего белка в сыворотке крови как по сравнению с интактными животными, так и по сравнению с животными с кровопотерей – соответственно на 7,97 и 24,25 %. Через 24 ч содержание белка в сыворотке крови не отличалось от его содержания у интактных животных.

Таким образом, направленный транспорт в печень АК в дозе 25 мг/кг через 6 ч после кровопотери способствует достоверному повышению, а через 24 ч – нормализации уровня общего белка в сыворотке крови экспериментальных животных.

Таблица 2

Условия эксперимента	Дозы аскорбиновой кислоты
	25 мг/кг	50 мг/кг	100 мг/кг
Контроль	69,50±2,60	71,99±4,52	75,90±4,33*
Направленный транспорт (6 ч)	76,44±2,22*^	78,00±4,47*^	79,89±4,88*^
Направленный транспорт (24 ч)	72,89±1,83^	76,82±4,05*^	79,82±2,97*^

Примечание. Достоверность различий по сравнению: * – с интактными животными; ^ – с животными с кровопотерей.

Влияние адресной доставки аскорбиновой кислоты в печень в дозировках 25, 50 и 100 мг/кг на содержание общего белка (г/л) в сыворотке крови белых крыс (М±m, n=12)

При направленном транспорте АК в дозе 50 мг/кг не происходило достоверного изменения содержания общего белка в сыворотке крови интактных животных (контроль) по сравнению с показателями нормы.

При введении АК животным с кровопотерей в сыворотке их крови наблюдалось достоверное повышение содержания общего белка по сравнению с аналогичным показателем как у интактных животных, так и у животных с кровопотерей. Так, через 6 ч его содержание повысилось на 10,17 %, а через 24 ч – на 8,5 % по сравнению с интактными животными; на 29,79 и 15,62 % – по сравнению с животными с кровопотерей.

Однократное введение АК интактным животным в дозе 100 мг/кг в ЭК (контроль) вызывает достоверное повышение уровня общего белка в сыворотке крови крыс на 7,20 % (с 70,8±4,56 до 75,9±4,33 г/л).

Как видно из данных табл. 2, однократное введение АК и через 6 ч, и через 24 ч после кровопотери способствует повышению уровня общего белка в сыворотке крови экспериментальных животных как по сравнению с интактными животными, так и по сравнению с животными с кровопотерей. Так, у животных с кровопотерей в условиях коррекции содержание общего белка через 6 ч достоверно повысилось на 29,86 % (с 61,52±4,41 до 79,89±4,88 г/л), а через 24 ч – на 20,14 % (с 66,44±4,41 до 79,82±2,97 г/л). По сравнению с интактными животными содержание общего белка через 6 ч достоверно повысилось на 12,84 %, а через 24 ч – на 12,74 %.

Таким образом, направленный транспорт в печень АК в ЭК в дозе 100 мг/кг приводит к достоверному повышению содержания общего белка в сыворотке крови на обоих изученных сроках после кровопотери.

Исследование показало, что введение АК интактным животным в дозе 25 мг/кг после включения в ЭК (контроль) не вызывает достоверного изменения процентного содержания альбуминов по сравнению с их уровнем в сыворотке крови интактных крыс (табл. 3).

Процентное содержание альбуминов через 6 и 24 ч после кровопотери при введении АК недостоверно отличалось от их содержания у интактных животных, но при этом имело тенденцию к повышению.

По сравнению с данными животных с кровопотерей содержание альбуминов через 6 ч имело тенденцию к снижению, а через 24 ч осталось на том же уровне.

Таким образом, однократное введение АК в дозе 25 мг/кг после кровопотери сохраняет процентное содержание альбуминов на уровне показателей интактных животных.

Таблица 3

Условия эксперимента	Доза аскорбиновой кислоты
	25 мг/кг	50 мг/кг	100 мг/кг
Контроль	49,29±2,02	47,79±5,84	56,24±1,95*
Направленный транспорт (6 ч)	49,30±1,51	46,53±3,24	59,83±3,43*^
Направленный транспорт (24 ч)	49,34±3,57	46,93±1,04	56,81±2,56*^

Примечание. Достоверность различий по сравнению: * – с интактными животными; ^ – с животными с кровопотерей.

Влияние адресной доставки АК в печень в дозировках 25, 50 и 100 мг/кг на процентное содержание альбуминов в сыворотке крови белых крыс (М±m, n=12)

При введении АК интактным животным в дозе 50 мг/кг после предварительного включения ее в ЭК процентное содержание альбуминов достоверно не изменяется по сравнению с их содержанием у интактных животных.

Введение АК ни через 6 ч, ни через 24 ч не вызывает достоверного изменения содержания альбуминов по сравнению их содержанием как у интактных животных, так и у животных с кровопотерей.

Результаты исследования показали, что направленный транспорт в печень АК в дозе

50 мг/кг сохраняет уровень процентного содержания альбуминов у экспериментальных животных в норме, и на всех изучаемых сроках этот уровень недостоверно отличается от уровня интактных животных.

Введение аскорбиновой кислоты интактным животным в дозе 100 мг/кг путем направленного транспорта в печень вызывает достоверное изменение содержания альбуминов в сыворотке крови крыс в сторону повышения – с 47,53±4,4 до 56,24±1,95 %, что составляет 118,33 % по сравнению с группой интактных животных.

При введении АК животным после кровопотери содержание альбуминов через 6 ч достоверно повысилось на 14,53 % (с 52,24±6,71 до 59,83±3,43 %), а через 24 ч – на 13,71 % (с 49,96±6,82 до 56,81±2,56 %) по сравнению с животными с кровопотерей. По сравнению с интактными животными содержание альбуминов тоже достоверно повысилось – на 25,88 и 19,52 % соответственно.

Как следует из представленных материалов, однократное введение АК в дозе 100 мг/кг после кровопотери при использовании ЭК на всех изученных сроках сохраняет повышенное содержание альбуминов в сыворотке крови крыс.

Результаты исследования, представленные в табл. 4, показывают, что введение АК в дозе 25 мг/кг вызывает достоверное увеличение содержания β-глобулинов до 10,41±1,36 %, что в 1,64 раза выше показателей интактных животных. Направленный транспорт в печень АК сохраняет повышенный уровень процентного содержания β-глобулинов в сыворотке крови крыс.

Таблица 4

Условия эксперимента	Доза аскорбиновой кислоты
	25 мг/кг	50 мг/кг	100 мг/кг
Контроль	10,41±1,36*	24,13±1,69*	25,79±1,27*
Направленный транспорт (6 ч)	24,31±0,79*	27,17±1,59*	28,14±4,65*
Направленный транспорт (24 ч)	24,71±2,93*	28,94±1,60*^	24,13±2,63*

Примечание. Достоверность различий по сравнению: * – с интактными животными; ^ – с животными с кровопотерей.

Влияние адресной доставки АК в печень в дозировках 25, 50 и 100 мг/кг на процентное содержание β-глобулинов в сыворотке крови белых крыс (М±m, n=12)

Введение АК в дозе 50 мг/кг в эритроцитарных носителях способствовало увеличению содержания β-глобулинов в 3,81 раза: с 6,33±0,51 до 24,13±1,69 % – по сравнению с их содержанием у интактных животных.

Изучение влияния АК в дозе 50 мг/кг показало существенное (р<0,05) изменение содержании β-глобулинов на всех изучаемых сроках по сравнению с их содержанием у интактных животных. Так, через 6 ч процентное содержание β-глобулинов составило 27,17± ±1,59 % (р<0,05), а через 24 ч – 28,94±1,66 % (р<0,05), что соответственно в 4,29 и 4,57 раза выше показателей интактных животных. По сравнению с показателями животных с кровопотерей содержание β-глобулинов через 6 ч имело тенденцию к повышению, а через 24 ч достоверно повысилось на 14,84 % (с 25,20±2,94 до 28,94±1,60 %).

При однократном введении АК в эритроцитарных контейнерах в дозе 100 мг/кг экспериментальным животным через 6 ч после кровопотери наблюдается тенденция к по- вышению содержания β-глобулинов, а через 24 ч – наоборот, тенденция к снижению их содержания по сравнению с животными с кровопотерей. По сравнению с интактными животными через 6 ч содержание β-глобули-нов повысилось в 4,45 раза (с 6,33±0,51 до 28,14±4,65 %, что составляет 444,55 %) (р<0,05), а через 24 ч – в 3,81 раза (с 6,33± ±0,51 до 24,13±2,63 %, что составляет 381,2 %).

Можно полагать, что эффективность АК в дозе 100 мг/кг связана с оказываемым ею мембраностабилизирующим и антиоксидантным действием в гепатоцитах. АК как донор электронов может отдавать их свободным радикалам и снижать их реактивность. Кроме того, аскорбиновая кислота в гетерогенных системах, содержащих липидную и водную фазы, выводит радикалы из легко окисляющейся липидной фазы в водную [20]. В экспериментальных исследованиях было показано, что аскорбиновая кислота может восстанавливать α-токоферильный радикал, тем самым возвращая α-токоферолу антиокси- дантные свойства [4]. Аскорбиновая кислота инициирует включение железа плазмы в состав тканевого ферритина, тем самым связывает каталитически активные формы железа, вызывающие перекисное окисление фосфолипидов [22].

Выводы:

• 1.    В условиях кровопотери содержание общего белка в сыворотке крови крыс через 6 ч после кровопотери достоверно снижается, а через 24 ч уже имеет тенденцию к нормализации. В то же время в содержании альбуминов в сыворотке крови прослеживается тенденция к увеличению на обоих сроках исследования по сравнению с их содержанием в сыворотке крови интактных крыс; содержание β-глобулинов достоверно увеличивается и через 6 ч после кровопотери, и через 24 ч, что, вероятно, является компенсаторным явлением в условиях кровопотери.

• 2.    Введение АК в ЭК после кровопотери во всех изученных дозах приводит к достоверному повышению уровня содержания общего белка в сыворотке крови экспериментальных животных.

• 3.    Введение АК в ЭК в дозах 25 и 50 мг/кг нормализует содержание альбуминов в сыворотке крови, а в высоких дозах (100 мг/кг) – значительно повышает, в результате чего повышается и коллоидно-осмотическое давление в условиях кровопотери.

• 4.    При направленном транспорте в печень АК во всех изученных дозах сохраняется повышенный уровень содержания β-гло-булинов, установившийся в условиях кровопотери.

• 1.    Биленко М. В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов (молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения) / М. В. Биленко. – М. : Медицина, 1989. – 368 с.

• 2.    Бугаев А. А. Заготовка аутоплазмы и проведение аутоплазмотрансфузий при хирургическом лечении гинекологических больных / А. А. Бугаев, Ю. В. Цвелев, С. П. Калеко // Журн. акушерства и женских болезней. – 2003. – Т. LII, № 4. – С. 33–37.

• 3.    Буеров А. О. Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени / А. О. Буеров // Российский журн. гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. – 2002. – № 4. – С. 21–25.

• 4.    Возможности использования антиоксидантов и антигипоксантов в экспериментальной и клинической медицине / Н. П. Чеснокова [и др.] // Успехи современного естествознания. – 2006. – № 8. – С. 18–25.

• 5.    Гарбузенко Д. В. Механизмы компенсации структуры и функции печени при ее повреждении и их практическое значение / Д. В. Гарбу-зенко // Российский журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2008. – Т. ХVIII, № 6. – С. 14–21.

• 6.    Генинг Т. П. Эритроциты млекопитающих в направленном транспорте биологически активных веществ / Т. П. Генинг. – Ульяновск : УлГУ, 1996. – 224 с.

• 7.    Гипоксия как основная причина нарушений гомеостаза у больных в критическом состоянии / Е. А. Кукаева [и др.] // Патогенез. – 2008. – Т. 6, № 3. – С. 69.

• 8.    Горбачев С. М. Биохимические механизмы адаптации при геморрагическом шоке / С. М. Горбачев, М. П. Козиев // Сибирский мед. журн. – 2006. – № 7. – С. 5–7.

• 9.    Данаа Л. С. Влияние плазмозамещающей терапии на показатели доставки и утилизации кислорода / Л. С. Данаа, А. Г. Самохин // Вестн. Новосибирского гос. ун-та. Сер. Биология, клиническая медицина. – 2009. – Т. 7, № 1. – С. 111–117.

• 10.    Жибурт Е. Б. Современная терапия острой массивной кровопотери / Е. Б. Жибурт, Г. Р. Иваницний, С. Ю. Пушкин // Тихоокеанский мед. журн. – 2004. – № 4. – С. 11–15.

• 11.    Карпищенко А. И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика : справ. : в 2 т. Т. 2 / А. И. Карпищенко. – СПб. : Интермедика, 1999. – 472 с.

• 12.    Коваленко Н. Я. Органоспецифические особенности кровоснабжения печени, почек и мозга при острой кровопотере у крыс с различной устойчивостью к циркуляторной гипоксии / Н. Я. Коваленко, Д. Д. Мациевский, Ю. В. Архипенко // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2001. – № 2. – С. 20–22.

• 13.    Ливанов Г. А. Метаболическая десинхронизация при критических состояниях (экспе риментальное исследование) / Г. А. Ливанов, М. В. Александров, Х. В. Батоцыренкова // Общая реаниматология. – 2006. – Т. 2, № 1. – С. 42–46.

• 14.    Мациевский Д. Д. Различия в кровоснабжении мозга и печени при острой кровопотере у крыс с различной устойчивостью к циркуляторной гипоксии / Д. Д. Мациевский, Н. Я. Коваленко // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. – 1997. – Т. 23, № 3. – С. 253–257.

• 15.    Механизмы развития острой гипоксии и пути ее фармакологической коррекции / М. А. Евсеева [и др.] // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2008. – Т. 6, № 1. – С. 3–25.

• 16.    Направленный транспорт лекарственных препаратов: современное состояние вопроса и перспективы / А. Г. Ивонин [и др.] // Известия Коми научного центра УрОРАН. – 2012. – № 9. – С. 46–55.

• 17.    Оценка метаболических сдвигов при гипоксии на молекулярно-клеточном уровне и возможности их медикаментозной коррекции / В. В. Бульон [и др.] // Успехи современного естествознания. – 2006. – № 12. – С. 29–32.

• 18.    Провоторов В. М. Роль и место эритроцитов в системе направленного транспорта различных фармакологических средств / В. М. Провоторов, Г. А. Иванова // Клиническая медицина. – 2009. – № 9. – С. 4–8.

• 19.    Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней / А. П. Шепелев [и др.] // Вопросы медицинской химии. – 2000. – № 2. – С. 110–116.

• 20.    Токаев Э. С. Биологически активные вещества, улучшающие функциональное состояние печени / Э. С. Токаев, Н. П. Блохина, Е. А. Нек-

  расов // Вопросы питания. – 2007. – № 4. – С. 4–8.

• 21.    Цой О. Г. Клетки крови как транспортные системы целенаправленной доставки лекарственных препаратов / О. Г. Цой, Е. А. Тайгулов, Ю. Ш. Иманбаева // Астана Медициналык журналы. – 2011. – Т. 66, № 4. – С. 7–12.

• 22.    Inhibition of iron/ascorbate-induced lipid peroxidation by an N-terminal peptide of bovine lactoferrin and its acylated derivatives / H. Wakabayashi [et al.] // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 1999. – Vol. 63, № 5. – P. 955–957.

• 23.    Ishikawa G. Countermeasure for obstetric hemorrhage / G. Ishikawa // Masui. – 2010. – Vol. 59, № 3. – P. 347–356.

• 24.    Sapirstein R. A. Effect of hemorrhage on the cardiac output and its distribution in the rat / R. A. Sapirstein, E. H. Sapirstein, A. Bredemeyer // Circ. Res. – 1960. – № 8. – P. 135–147.

• 25.    Succinate is a paracrine signal for a liver damadge / P. R. Correa [et al.] // J. of Hepatology. – 2007. – Vol. 47, № 2. – P. 262–269.

PROTEIN COMPENSATION OF BLOOD LOSS WHEN USING DIRECTED TRANSPORT OF ASCORBIC ACID TO THE LIVER

D.A. Kseyko, T.P. Gening, M.N. Avakova

Ulyanovsk State University