Биодеградация полиакриламидов почвенной микрофлорой и штаммами амидазосодержащих бактерий

Полиакриламиды и полиакрилаты могут содержать следовые количества токсичных мономеров, кроме того, есть вероятность высвобождения этих мономеров при деградации полимеров. Так, известны случаи отравления акриламидом у пациентов, подвергнутых инъекциям препарата для пластической хирургии, содержащего полиакриламид [Wang, Du, Yu, 2013]. Использование акриловых полимеров в составе буровых растворов для увеличения нефтеотдачи пластов и укрепления стенок скважин может служить источником загрязнения окружающей среды. Поэтому проблема деградации полиакриламидов и полиакрилатов должна всесторонне изучаться, в том числе и в ракурсе биологической деструкции.

Немногочисленные сведения о штаммах бактерий, разлагающих полиакриламид, подтверждают возможность использования микроорганизмами этого полимера как источника азота [Matsuoka et al., 2002; Bao et al., 2010], либо углерода [Matsuoka et al., 2002; Wen et al., 2010; Сипулинов и др., 2014; Yu et al., 2015] для роста. Очевидно, что возможность утилизации полиакриламида в качестве источника энергии и/или азотного питания связана с наличием амидазной активности [Kay-Shoemake et al., 2000; Yu et al., 2015]. В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение влияния полиакриламидов на общую амидазную активность почвы и количество амидазосодержащих микроорганизмов и изучение особенностей роста штаммов, обладающих амидазной активностью, на полиакриламиде как источнике углерода и/или азота.

Материалы и методы исследования

Для изучения процесса долговременной биодеструкции полиакриламида в колбы объемом 250 мл со 100 мл безазотистой минеральной среды (N) состава (г/л): KH 2 PO 4 – 1.0; K 2 HPO 4 ×3H 2 O – 1.6; NaCl – 0.5; MgSO 4 ×7H 2 O – 0.5, CaCl 2 – 0.005; FeSO 4 ×7H 2 O – 0.01; CoCl 2 ×6H 2 O – 0.01 (рН 7.2±0.2) внесли 1 г сырой дерново-луговой тяжелой суглинистой ( 1 ) и аллювиальной луговой ( 2 ) почвы (пробы отобраны в с. Чайковская Нытвенского р-на Пермского края) и песчаника нефтенасыщенного, кварцевого, мелкозернистого ( 3 ), отобранного из Черновского месторождения, в 15 км от пос. Шаркан Удмуртской республики, с глубины 1 405 м. В среду внесли полиакриламид марок «Биосорб» (ЗАО Ашленд – МСП) или ВУМ 36/0

(Институт технической химии УрО РАН, Пермь). Контролем служили почвенные вытяжки без добавления ПАА. Среды инкубировали на качалке со скоростью перемешивания 120 об/мин при 25ºС в течение 38 недель.

Содержание амидазосодержащих микроорганизмов определяли по количеству КОЕ/мл при высеве из 10-кратных разведений почвенной вытяжки на агаризованную минеральную среду с 10 мМ ацетамидом как единственным источником углерода и азота.

Для определения общей амидазной активности почвенных микроорганизмов к 1 мл пробы почвенной вытяжки добавляли 10–50 мМ раствор ацетамида или акриламида в качестве субстрата, инкубировали при 30˚С, через 1–48 ч останавливали реакцию добавлением HCl до концентрации 5%, центрифугировали 10 мин при 11 тыс. об/мин. Концентрацию акриламида и акриловой кислоты, ацетамида и уксусной кислоты в надосадочной жидкости определяли методом ВЭЖХ и ГХ соответственно.

После 38 недель инкубации почвенной вытяжки с ПАА остаточный ПАА высушивали при 70ºC до постоянного веса и взвешивали на аналитических весах.

Суспензию штаммов амидазосодержащих бактерий Alcaligenes faecalis 2 и Acinetobacter guillouiae 11h инокулировали по 100 мкл в 50 мл среды N, содержащей 0.1 М ацетат натрия в качестве источника углерода и 50 мг ПАА (ВУМ 36/0) в качестве источника азота. Микроскопию гранул ПАА проводили через 4–7 сут в световом микроскопе Leica DM LS (Германия) с фазовым контрастом при увеличении 1 000 раз.

Результаты и их обсуждение

При долговременной инкубации почвенной вытяжки с ПАА разных типов было отмечено возрастание ацетамид-утилизирующих бактерий в суглинистой и аллювиальной луговой почвах, что выражалось в увеличении КОЕ/мл при высеве почвенной вытяжки на агаризованную синтетическую минеральную среду с ацетамидом как единственным источником углерода и азота (табл. 1) и в увеличении общей амидазной активности почвы (табл. 2).

Таблица 1

Содержание амид-утилизирующих микроорганизмов в почвах при длительной инкубации с ПАА, КОЕ/мл

Проба		Продолжительность эксперимента, недели
		3	6	8	25	35	38
1	Контроль	3.5×107	2×107	8×107	2×107	5×108	6×108
	«Биосорб»	1.2×108	1.7×108	6×108	8.3×108	-	1.6×109
	ВУМ 36/0	4.7×106	1.4×107	3×107	-	5×108
2	Контроль	3.3×105	4.8×105	8×105	-	3×108	9×108
	«Биосорб»	1.1×106	1.6×106	-	4×107	4×108	2.8×109
	ВУМ 36/0	8×105	8×105	-	2×107	-	1.1×109

Таблица 2

Общая амидазная активность почвенной вытяжки при долговременной инкубации с

ПАА, мкмоль/мл/ч

Проба		Продолжительность эксперимента, недели
		6	27	34
1	Контроль	0.017	0.078	8.529
	«Биосорб»	0.046	0.256	9.077
	ВУМ 36/0	0.032	0.263	10.439
2	Контроль	0.010	0.248	6.003
	«Биосорб»	0.029	0.085	10.749
	ВУМ 36/0	0.012	0.249	9.443
		9	16
3	Контроль	0.229	3.684
	«Биосорб»	0.218	2.905
	ВУМ 36/0	0.195	1.975

Для образцов суглинистой почвы обнаружено повышение амидазной активности и увеличение числа жизнеспособных амид-утилизирующих бактерий при инкубации с ПАА по сравнению с контролем. Для аллювиальной почвы эта тенденция также заметна, за исключением пробы, взятой через 27 недель. Однако для песчаной почвы такой тенденции не наблюдалось, и общая амидазная активность почвенной вытяжки была даже ниже, чем контрольной. Следовательно, на микрофлору суглинистой и аллювиальной почвы оказывает воздействие как ПАА типа «Биосорб», так и ВУМ 36/0, влияя на общее содержание и активность амид-гидролизующих микроорганизмов. Нами ранее было показано, что ПАА марки ВУМ 36/0 не оказывает заметного влияния на почвенные бактерии Bacillus subtilis ATCC 6633 и Pseudomonas fluorescens C2 как в водной среде, так и в почве [Максимова и др., 2010], однако изученные ранее штаммы не обладали амидазной активностью.

До настоящего времени микробная деградация ПАА остается недостаточно исследованной. Так, существует мнение, что ПАА подвергается физикохимической деградации, после чего короткие отрезки полимера разрушаются микрофлорой почвы [Смагин, 2012, Смагин, Садовникова, Смагина, 2014]. В наших исследованиях гравиметрическим методом было определено, что только при инкубации с аллювиальной почвой в течение 38 недель заметно снижается масса ПАА. При инкубации с суглинистой почвой и песчаником убыль ПАА обеих марок не отмечалась. В аллювиальной почве убыль ВУМ 36/0 составила 37%, «Биосорба» – 10%.

С целью более детального изучения возможности использования ПАА бактериями в качестве источника углеродного или азотного питания штаммы Al. faecalis 2 и Ac. guillouiae 11h, обладающие амидазной активностью, культивировали с ПАА ВУМ 36/0 на жидкой синтетической минеральной среде без источника азота и с ацетатом натрия как источником углерода, либо без дополнительных источников углерода и азота. На среде с ацетатом натрия наблюдали рост амидазосодержащих бактерий на гранулах ПАА. При микроскопировании гранул в фазовом контрасте с увеличением и 1000 раз было показано нарастание биопленки на поверхности гранул (рисунок). Изученные штаммы не использовали ПАА как источник углерода.

Образование биопленки на гранулах ПАА: А – Ac. guillouiae 11h, Б – Al. faecalis 2. Масштабная линейка соответствует 15 мкм

Таким образом, содержание бактерий, обладающих амидазной активностью, в аллювиальной и суглинистой почве при длительной инкубации с ПАА возрастает, причем за 38 недель убыль ПАА отмечается только в аллювиальной почве – от 10 до 37% от внесенного количества ПАА. Способность амидазосодержащих бактерий использовать ПАА в качестве источника азота подтверждается образованием биопленок на гранулах геля в отсутствии иного источника азота, но с внесением дополнительного источника углерода.

Работа поддержана Комплексной программой Уральского отделения РАН (0426-2015-0028), проект № 15-4-4-26 «Биосинтез и биокаталитическая трансформация полимерных соединений».