Биодеструкция смоляных кислот - доминирующих токсичных соединений в отходах целлюлозно-бумажной промышленности

Значительная часть токсичных веществ в жидких отходах целлюлозно-бумажной промышленности приходится на смоляные кислоты, представляющие собой трициклические дитерпеноиды [Walden, Howard, 1977; Kovacs, Voss 1992; Pulp bleaching ..., 1993; Liss, Bicho, Saddler, 1997]. Смоляные кислоты - это группа экстрактивных веществ, обычно встречающихся в живице хвойных деревьев (сосна, ель, пихта). Они составляют до 0.2-0.8% от общей массы древесины. [Fengel, Wegner, 1985; Liss, Bicho, Saddler, 1997]. В процессе химического и механического воздействия на древесину для получения целлюлозы, смоляные кислоты высвобождаются и в дальнейшем через сточные воды попадают в окружающую среду.

При попадании в открытые экосистемы данные вещества аккумулируются и могут оказывать токсическое действие на живые организмы [Bicho, Martin, Saddler, 1995; Zheng, Nicholson, 1998; Leppanen, Oikari, 1999]. В качестве эффективного способа снижения концентрации смоляных кислот признаны биотехнологические методы с использованием микроорганизмов [Liss, Bicho, Saddler, 1997]. Данные методы не требуют применения агрессивных реагентов и позволяют осуществлять

максимальное извлечение смоляных кислот в «мягких» условиях при физиологических температурах, нормальном давлении и нейтральных значениях pH среды.

Поскольку смоляные кислоты широко распространены в окружающей среде в микроколичествах, существует большое число грибов и бактерий, способных частично или полностью деградировать смоляные кислоты [Mohn, 1995; Liss, Bicho, Saddler, 1997; Martin, Yu, Mohn, 1999; Morgan, Wyndham, 2002]. В настоящее время перспективным является получение на основе смоляных кислот биологически активных соединений, пригодных в качестве интермедиатов синтеза лекарственных средств.

Химические свойства и токсичность смоляных кислот

Смоляные кислоты представляют собой природные дитерпеновые трициклические карбоновые кислоты [Scientific ..., 1988; Liss, Bicho, Saddler, 1997]. Они подразделяются на смоляные кислоты абиетанового и пимаранового типа. Кислоты абиетанового типа имеют изопропильную группу у С-13 атома углерода, в то время как смоляные кислоты пимаранового типа имеют в этом положе- ный [Mutton, 1962; Stoltes, Zinkel, 1989]. Тишиными представителями дитерпеновых кислот абиетанового типа, содержащихся в отходах бумажной промышленности, являются (АК) абиетиновая, (ДАК) дегидроабиетиновая, (НАК) неоа- биетиновая и (J1L1K) левопимаровая кислоты (ри-сунок). Смоляные кислоты пимаранового типа включают изопимаровую (ИНК), (ПК) пимаровую и сандаракопимаровую (СПК) кислоты [Liss, Bicho, Saddler, 1997].

Тип абиетана                                                            Тип пимарана

Сандаракопимаровая кислота

Неоабиетиновая кислота Левопимаровая кислота

Структурные формулы смоляных кислот абиетанового и пимаранового ряда

Смоляные кислоты являются гидрофобными соединениями, о чем свидетельствует их растворимость в водных системах. Так, растворимость АК и ДАК при кислых и нейтральных значениях pH и температуре 20°С равна 3-5 и 4-6 мг/л соответственно [Nyren, Back, 1958]. Кроме того, показано, что на растворимость данных смоляных кислот влияют значения температуры и pH среды [Nyren, Back, 1958; Zanella, 1983; Suckling, Hua, Uprichard, 1990]. Предполагается, что именно растворимость влияет на распределение смоляных кислот и транспорт через очистные фильтры [Liss, Bicho, Saddler, 1997].

Токсичность стоков бумажной промышленности обусловлена наличием в них смоляных кислот. Это становится очевидным при рассмотрении острой токсичности по отношению к некоторым видам рыб. Так, в исследованиях B.R. Taylor с соавт. [Scientific ..., 1988] показано, что значения острой токсичности (96 ч ЛД50) восьми смоляных кислот по отношению к нескольким видам лосося, радужной форели, гольяна распределялись от 0.5 до 1.7 мг/л, тогда как концентрация смоляных кислот в стоках может достигать до 550 мг/л [Elimination ...,2006].

Смоляные кислоты обнаружены в желчи рыб в количествах от 120 до 330 мкг/мл и от 13 до 620 мкг/г в ткани мозга рыб [Zheng, Nicholson, 1998; Leppanen, Oikari, 1999], что указывает на возможную аккумуляцию их в открытых экосистемах. Показано, что значения острой токсичности (48 ч ЛД₅₀) смоляных кислот по отношению к Daphnia magna в 2-3 раза меньше, чем таковые по отношению к рыбам. По данным [Zanella, 1983; Identi-

fication ..., 1994], смоляные кислоты менее токсичны по отношению к беспозвоночным животным (табл. 1). Таблица 1 Острая токсичность смоляных кислот
Тестовые орга-низмы	Смоляные кислоты, мг/л
	АК	ДГ	ипк
Daphnia magna (48 ч, ЛД 50)	19.2	2.5-6.4	1.3
Rainbow trout (96 ч, ЛД 50)	0.7- 1.5	0.8- 1.7	0.5- 1.0
Fathead minnowe (96 ч, ЛД 50)	0.1	3.2	0.1
Примечание. * Цит. по: Liss, Bicho, Saddler, 1997.

Биодеградация смоляных кислот

Наиболее эффективных способом утилизации смоляных кислот является биологическая обработка сточных вод. По данным некоторых авторов [McFarlane, Clark, 1988], применение активного ила и газированных лагун позволяет снизить уровень абиетановых смоляных кислот в стоках на 90%, при этом утилизация кислот пимаранового типа менее продуктивна и составляет 60%.

В качестве эффективного способа утилизации смоляных кислот используются анаэробные системы. Сторонники их применения предполагают, что использование закрытых систем в процессе переработки целлюлозы существенно уменьшит объем жидких отходов и приведет к более концентрированным стокам. , . ;

жидких отходов и приведет к более концентрированным стокам.

Казалось бы, концентрированные отходы должны значительно повысить привлекательность применения анаэробных систем за счет снижения эксплуатационных затрат, в частности, снижения потребности в энергии или уменьшения формирующегося осадка [Lee, Petersen, Stickney, 1989]. Однако, по мнению отдельных авторов [Lee, Petersen, Stickney, 1989; MacClean, Vegt, Driel, 1990],

gradation ..., 1973; Morgan, Wyndham, 1996], Ar-thobacter [Levinson, Carter, Taylor, 1968], Bacillus, Escherichia, Flavobacterium [Hemingway, Greaves, 1973; Degradation ..., 1973], Cornamonas [Morgan, Wyndham, 1996], Pseudomonas [Hemingway, Greaves, 1973; Degradation ..., 1973; Wilson, Moore, Mohn, 1996], Sphingomonas, Zooglea [Mohn, 1995] способны утилизировать ДАК. Предположительно, это связано с тем, что данной смоляной кислоты в окружающей среде содержится больше. Дитерпе

данные системы менее производительны из-за наличия в концентрированных стоках ингибиторов ферментных систем анаэробных микроорганизмов.

Эффективным способом деградации отдельных смоляных кислот является применение чистых культур микроорганизмов. Бактерии, выделенные из почв, коры деревьев и природных водных систем, обладают способностью утилизировать дитерпеновые кислоты (табл. 2). Представители родов Alcaligenes, Cornamonas [Morgan, Wyndham, 1996], Pseudomonas [Wilson, Moore, Mohn, 1996], Sphingomonas, Zooglea [Mohn, 1995] способны деградировать AK. Представители значительно

ны пимаранового типа сложнее утилизировать, и на это способны лишь отдельные представители родов Cornamonas, Alcaligenes [Morgan, Wyndham, 1996] и Pseudomonas [Wilson, Moore, Mohn, 1996]. В работе P.A. Bicho, V. Martin, J.N. Saddler [1995] микроорганизмы, выделенные непосредственно из сточных вод целлюлозно-бумажных комбинатов, способны деградировать до 65% смоляных кислот абиетанового типа. По данным Т.А. Burnes, R.A. Blanchette, R.L. Farrell [2000], представители Хап-thomonas campestris и Serratia marcescens деградируют до 40% смеси смоляных кислот древесных экстрактов.

больших родов микроорганизмов Alcaligenes [De- Таблица 2 Микроорганизмы - деструкторы смоляных кислот
Вид, род	Субстрат	Автор
Бактерии
Burkholderia sp.	ДАК	Physiological ..., 1999; Distinct, 2008
Cupriavidus sp.	ДАК; AK	Bicho, Martin, Saddler, 1995
Pseudomonas vancouverensis “Pseudomonas multiresinivorans” (Pseudomonas nitroducenf)*	ДАК	Physiological ..., 1999; Yu, Mohn, 1999; Wilson, Moore, Mohn, 1996
Pseudomonas reinekei, Pseudomnas moorei, Pseudomonas mohnii	ИПК	Pseudomonas reinekei ... , 2007
Pseudomonas sp.	ДАК	Wilson, Moore, Mohn, 1996; Yu, Mohn, 1999
Bacillus sp., Escherichia, Flavobacterium sp., Flavobacterium resinovorum	ДАК	Hemingway, Greaves, 1973; Degradation ..., 1973
Pseudomonas sp.	ДАК; АК; ИПК	Hemingway, Greaves, 1973; Degradation ..., 1973; Wilson, Moore, Mohn, 1996
Bacillus mycoides, Pseudomonas acidouorans, Pseudomonas aeruginosa	ДАК	Studies ..., 1981
Alcaligenes eutrophus	ДАК	Degradation ..., 1973
Arthobacter sp.	ДАК	Levinson, Carter, Taylor,1968
Sphingomonas sp., Zooglea sp.	ДАК; АК	Mohn, 1995
Cornamonas spp., Alcaligenes spp.	ДАК; АК; НАК; ПК; ИПК; ЛК	Morgan, Wyndham, 1996
Грибы
Ascochyta pinodella, Aureobasidium pullulans, Cephalosporium sp., Fusarium culmorum, Lentinus lepi-deus, Mortierella isabellina, Mucor globosus, Nodulisporium sp., “Polyporus hirsutus” (Trametes hir-suta)*, Polysporus versicolor, Stereum purpureum, Trichoderma uiride	ДАК	Studies ..., 1981; 1982

Примечание. * Инвалидные виды или устаревшие названия таксонов бактерий (согласно существующим правилам) приведены прямым шрифтом и в кавычках. В скобках приведены современные названия таксонов (если таковые имеются).

Деградирующей способностью в отношении смоляных кислот также обладают грибные культуры. Например, грибы Ascochyta pinodella, Aureoba-sidium pullulans, Cephalosporium sp., Fusarium cul-morum, Lentinus lepideus, Lenzites trabea, Mortierel-la isabellina, Mucor globosus, Nodulisporium sp., “Polyporus hirsutus” (T^rametes hirsuta), Polysporus versicolor, Stereum purpureum, Trichoderma uiride способны эффективно (от 60 до 90%) утилизировать ДАК [Studies ..., 1981; Biotransformation ..., 1985]. Однако применение грибов в качестве биокатализаторов процесса биодеградации смоляных кислот потенциально опасно вследствие характера их посевного материала (споры) и способности к синтезу микотоксинов, обладающих мутагенным и канцерогенным действием.

Биотрансформация смоляных кислот

В настоящее время перспективным является не только поиск новых технологий утилизации смоляных кислот, но и получение на их основе новых биологически активных соединений. Эго становится возможным благодаря применению приема микробной биотрансформации. Использование микроорганизмов в качестве биокатализаторов, в отличие от химического синтеза, не требует применения агрессивных реагентов, процесс протекает в одну технологическую стадию, и биокатализ позволяет осуществлять направленную трансформацию с высокой степенью стерео- и региоселек-тивности. Примерами таких превращений являются реакции гидроксилирования, окисления и декарбоксилирования. Гидрокси- и оксопроизводные смоляных кислот обладают выраженной биологической активностью, благодаря чему они могут использоваться в качестве интермедиатов синтеза лекарственных средств.

Наиболее эффективной признается бактериальная трансформация смоляных кислот. Однако бактериальные клетки катализируют лишь ограниченный круг реакций гидроксилирования и окисления. Так, при трансформации канифоли, которая преимущественно содержит ДАК, представителями A. oxydans и В. amyloliquefaciens детектируются в качестве продуктов 7-гидроксидегидроабиетиновая, 15-гидроксидегидроабиетиновая, 7-оксодегид-ро-абиетиновая и 15-гидрокси-7-оксодегидро-абие-тиновая кислоты [Study ..., 2008]. Образование 7-оксо и 15-гидроксипроизводных наблюдалось при трансформации ДАК клетками Rhodococcus erytro-polis [Microbial ..., 2001]. Биотрансформация данного субстрата с использованием представителей Pseudomonas sp. также приводит к образованию 7оксопроизводных [Smith, Martin, Mohn, 2004].

Грибы способны катализировать больше разнообразных реакций по сравнению с бактериями.

Например, гидроксилирование абиетановых смоляных кислот с использованием отдельных представителей грибов чаще всего происходит только в определенных положениях, в частности Corticum sasaki (С-3), Fomes annosus (С-1, С-15 и С-16), Mucor circinelloides (С-2) или Mortierella isabellina (С2, С-15 и С-16). Представители Chaetomium coch-lioides трансформируют ДАК с образованием 15,16-дигидрокси-8,11,13 -абиетатриен-18-оновой кислоты [Biotransformation ...,1985; Liss, Bicho, Saddler, 1997; Regio- and stereo-selective ..., 2005]. Использование иммобилизованных и покоящихся клеток Mortierella isabellina позволяет получать 15- и 16-гидрокси-8,9,11,12-тетрадегидро-7,8-дигидроабие-тиновую кислоты из ДАК практически при полной (94%) её биоконверсии [Biotransformation ..., 1985]. Представители Moraxella sp. катализируют образование 3,7-диоксидегидро-абиетина из ДАК [Regio- and stereo-selective ..., 2005], а представители Fusarium oxysporum и F. moniliforme катализируют образование 1-гидроксипроизводных. При биотрансформации ДАК с использованием микроскопических грибов A. niger обнаружено образование 1р,7[3-дигидрокси-производных [ lb,7b-Dihydroxydehydroabietic ..., 2004]. Уровень биотрансформирующей активности у грибов в отношении ДАК может достигать 75%.

По данным многочисленных исследований [Wilson, Moore, Mohn, 1996; Liss, Bicho, Saddler, 1997; Martin, Yu, Mohn, 1999], смоляные кислоты пимаранового типа более устойчивы к биотрансформации. Это объясняется тем, что данные дитерпены не имеют сопряженных двойных связей и поэтому устойчивы к воздействию микроорганизмов.

Заключение

Смоляные кислоты являются одной из приоритетных групп экотоксикантов сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности. Данные соединения способны оказывать токсическое воздействие на живые организмы. Современные методы утилизации смоляных кислот включают применение микробиологической обработки. Благодаря распространению смоляных кислот в окружающей среде, существует широкий круг грибов и бактерий, способных деградировать смоляные кислоты в той или иной степени. Однако наиболее эффективным способом деградации в настоящее время считается применение активного ила и газированных лагун. Использование микроорганизмов позволяет не только снизить уровень токсичных смоляных кислот, но и получать на их основе биологически активные соединения, перспективные в качестве интермедиатов для тонкого органического синтеза. Получаемые в процессе биокатализа абиетановых кислот гидрокси- и оксо-продукты обладают выраженной противоопухолевой и противовирусной активностью. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что примеры биотрансформации смоляных кислот пимаранового типа пока немногочисленны и связаны преимущественно с использованием эукариотов, в частности представителей грибов Aspergillus, Mortierella. Необходимо отметить, что использование грибов в качестве биокатализаторов процесса биотрансформации смоляных кислот нетехнологично и даже потенциально опасно.

Проведенный анализ литературных данных показал, что смоляные кислоты обладают значительным потенциалом модификации в биологически активные соединения. В последние годы наблюдается повышенный интерес к продуктам, образующимся в результате биотрансформации смоляных кислот и обладающих выраженной противоопухолевой и противовирусной активностью. Наиболее перспективным является использование бактериальных биокатализаторов вследствие специфики их многоцелевых ферментных систем и устойчивой активности в экстремальных условиях внешней среды.