Биохимические характеристики микроорганизмов щелочных гидротерм Прибайкалья

В гидротермах Бурятии широко распространены микроорганизмы – потенциальные продуценты ферментативных систем, устойчивые к высоким значениям температуры и рН. Исследования по выделению, идентификации и классификации ферментов протеолитической активности в последние годы проводятся особенно интенсивно, что объясняется востребованностью и многообразием протеолитических ферментов. Они играют ключевую роль в использовании микроорганизмами органических субстратов [1].

Целью представленной работы было изучение внеклеточной протеазной активности у гетеротрофных алкалотермофильных бактерий, выделенных из гидротерм Бурятии.

Объекты и методы исследования

В качестве источников секретируемых протеолитических ферментов использовали культуральную жидкость 5 алкало-термофильных культур Ur-6, Br-2-2, Ga-9-2, Al-9-1 и Se-1, выделенных из микробных матов и донных осадков горячих источников Байкальской рифтовой зоны. Температура воды в точках отбора проб на выходе и по изливу термальных вод в изученных источниках варьировала от 45 (источник Сея) до 72,50С (источник Гарга). Значения pH изменялись от слабощелочных 8,2 в воде источников Гарга до сильнощелочных 9,9 в гидротерме Алла. Выделенные штаммы Ur-6 и Br-

2-2 относятся к представителям рода Bacillus . Наибольшее сходство у культуры Ur-6 выявлено с Bacillus hemicellulosolyticum C-11 (99%). Штаммы Br-2-2 на 97% близки к B. licheniformis BBDC6 . У штамма Ga-9-2 обнаружено 95% сходства с A. flavithermus DSM 2641 ( Z26932). Штаммы Al-9-1 и Se-1 образуют отдельный кластер на филогенетическом дереве, и ближайшим гомологом является Anoxybacillus pushchinoensis AT-2 (AB234214). Сходство составляет 96 и 95% соответственно .

Определение внеклеточной протеазной активности в культуральной жидкости у изученных культур проводили по методу Эрлангера [2], используя 5 мМ пара-нитроанилидные субстраты протеаз – трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, субтилизиноподобных, цистеиновых и аминопептидаз (BAPA, GlpFpNA, GlpAALpNA, GlpFApNA и TpNA, ApNA, LpNA соответственно) и на белковом субстрате азоказеине, используемом для определения общей активности. Для выяснения природы функциональных групп активного центра штаммов к раствору фермента добавляли раствор соответствующего ингибитора, инкубировали 40 мин при температуре 370С, затем добавляли раствор субстрата и определяли активность, как указано выше. В работе использовались ингибиторы металло-протеаз–этилендиаминтетраацетат Na (ЭДТА), цистеиновых протеаз-иодацетамид (ИAA) и сериновых протеаз–фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Для определения оптимума рН активности исследуемых протеиназ по отношению к синтетическим субстратам были использованы цитратфосфатные, фосфатные, гидрокарбонатные буферы [3] в диапазоне рН 5-12. Температурный оптимум ферментов определяли, измеряя их активность после 5 мин инкубации при температурах от 23-800С.

Результаты и обсуждение

• 1.    Определение субстратной специфичности

• 2.    Определение температурной стабильности фермента

  Внеклеточная протеиназа штамма Ur-6 имела оптимум активности при 60⁰С и сохраняла до 31% активности при 70⁰С. Температурная стабильность фермента находилась в интервале температур 2360⁰С. Культура Ga-9-2 показала оптимум активности при 50⁰С, тогда как культура Br-2-2 при 40⁰С. Стабильность ферментов изученных штаммов сохраняется до 60⁰С (рис. 2).

• 3.    Определение рН - оптимума и стабильности фермента

Определение субстратной специфичности показало, что изученные штаммы не гидролизуют субстраты, специфичные для химотрипсинподобных и цистеиновых протеиназ, независимо от времени культивирования (до 60 ч) и источников органического азота (триптон, казеин и желатин). Все изученные культуры наиболее активны в отношении субстратов, специфичных для субтилизинов и аминопептидаз (рис. 1). Результаты исследования зависимости активности протеиназ от температуры культивирования показали, что наиболее высокая активность на субстрате для субтилизиноподобных протеиназ обнаружена при 500С. При этой температуре максимальная удельная активность у культуры Ur-6 обнаружена на 12 ч культивирования и составила 3,24 ед/мг. Показано, что температура 600С является наиболее благоприятной для развития аминопептидазной активности. В целом отмечено, что культуры Ur-6, Br-2-2, Ga-9-2, выделенные из микробных матов горячих источников, кроме суб-тилизиноподобной обладают высокой аминопептидазной активностью. Характерно, что наибольшая активность по субстрату для субтилизиноподобных протеиназ обнаружена на среде с триптоном. Добавление в среду желатина или казеина приводило к слабой индукции субтилизиноподобных протеиназ.

Исследования рН оптимума и стабильности проведены в диапазоне рН 5,8–12,0 для трех культур: Ur-6, Ga-9-2 и Br-2-2 (рис. 3). Как следует из полученных данных, изученные ферменты штаммов Ga-9-2 и Br-2-2 активны в относительно узком интервале рН: активность, превышающая 50%, была выявлена на участке рН 10-12 с максимумом при рН 11,7 и 11,3 соответственно. Исследуемые ферменты были стабильны при рН 10,9- 12,0. Напротив, протеиназа культуры Ur-6 активна в широком диапазоне рН, значения активности более 50% были выявлены на отрезке рН 7,3-12, с максимумом при рН 10. Фермент сохранял стабильность в интервале рН 7,8-12.

Общая активность на азоказеине

□ Br-2-2

Ga-9-2

□ Sе-1

Аl-9-1

Ur-6

вре мя культивирования , ч

Активность Br-2-2 на различных субстратах

□ БАПА

□ субтилизин

□ аргинин

□ тирозин

□ лейцин

12 24 36 48         12 24 36 48

время культивирования , ч .

Активность Ga-9-2 на различных субстратах

□ БАПА

□ субтилизин

□ аргинин

□ тирозин

□ лейцин время культивирования, ч.

Активность Ур -6 на различных субстратах

1,6

1,4

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

□ БАПА

□ субтилизин

□ аргинин

□ тирозин лейцин

12 24 36 48        12 24 36 48

вре мя культивирова ния , ч

Рис. 1. Внеклеточная протеазная активность на различных субстратах

Температурный оптимум и стабильность

Рис. 2. Температурный оптимум и стабильность культур Ga-9-2, Br-2-2, Ur-6

рН оптимум и стабильность Ur-6, Ga-9-1 и Br-2-2

3,5

2,5

1,5

0,5

%

рН

Ur-6 опт

Ga-9-1 опт

Br-2-2 опт

Ur-6 стаб

Ga-9-1 стаб

Br-2-2 стаб

<Ь „ Ъ . Ф <Ь <ь £. д. д. ^У %, О,У О,.

Рис. 3. рН оптимум и стабильность культур Ga-9-2, Br-2-2, Ur-6