Биохимические особенности адаптации растений к нефтяному загрязнению

В последнее время все большее значение приобретают исследования, выясняющие особенности экологического равновесия в биосфере и механизмы его поддержания и нарушения, в том числе такие, в которых участвуют различные органические вещества, в осо- бенности вторичные метаболиты. Одной из причин этого является антропогенное воздействие на биосферу, вызывающее обоснованное беспокойство в связи с возможностью нарушения экологического баланса в отдельных участках биосферы. Кроме того, эколого-физиологические исследования совместно с характеристикой условий среды обитания дают возможность объяснить расселение растений, изменчивость их биохимических показателей выживания в различных климатических условиях [1, 2].

Самоочищение и самовосстановление почвенных экосистем, нарушенных загрязнением нефтью и нефтепродуктами, - это стадийный биогеохимический процесс трансформации загрязняющих веществ, сопряженный со стадийным восстановлением биоценоза. Для разных природных зон длительность отдельных стадий этого процесса различна (от нескольких месяцев до нескольких десятков лет), что связано в основном с почвенно-климатическими условиями. Большое влияние оказывают состав нефти и нефтепродуктов, начальная концентрация загрязняющих веществ [3].

Скорость биодеградации нефти зависит от интенсивности солнечного света, концентрации биогенных элементов, температуры, давления, концентрации кислорода, генетических регуляторных механизмов, наличия беспозвоночных животных.

В условиях «экологической нагрузки» биоиндикатором состояния организмов и среды их обитания может служить изменчивость содержания ряда вторичных метаболитов в синтезирующих их растениях. Хотя продолжаются обсуждения адаптивного значения растительных вторичных метаболитов, очевидность их накопления свидетельствует о важной экологической роли этих метаболитов как во взаимодействии растений с компонентами их биоты, так и в защите от физических стрессов среды обитания [4, 5, 6]. А.М. Носовым выдвинута гипотеза о мультифункциональности вторичных метаболитов растений и подчеркнута их главная экологическая роль [7].

Биохимические подходы к исследованию растительного многообразия связаны с изучением полезных растений и возникают на базе сравнительной биохимии, решающей в настоящее время важные практические задачи [8].

Объекты и методы исследования

Функциональные свойства почвы, загрязненной нефтью, имеют разную чувствительность к неблагоприятным факторам среды. Полевые опыты проводились методом микроделянок на светло-каштановой среднезасоленной, среднесуглинистой почве, загрязненной товарной нефтью Улан-Хольского месторождения в результате разлива на территорию 500 мл нефти на 1 м² методом бороздок. Содержание нефти в почве составило 10% от массы почвы. Контролем служили образцы почв с незагрязненных участков. На нефтезагрязненном участке заложены опытные делянки площадью 15 м². Делянки подвергнуты рекультивации с внесением органо-минеральных удобрений в количестве N30P60K30 (мочевины 60 г, суперфосфата 113 г, сульфата калия 67 г на 1 м²) для ускорения разложения нефти в почве. В своих исследованиях по подбору культур исходили из реальных почвенно-климатических условий региона и выбрали амарант, овес, кресс-салат и ячмень. Эти делянки были подвергнуты фитомелиорации с помощью посева в загрязненную почву растений ячменя обыкновенного ( Hordeum districhon ), овса обыкновенного ( Avena fatua L .), кресс-салата ( Lepidium sativum L. ) и амаранта (ширицы) жминдовидной ( Amarantus retroflexus l ).

Для изучения биохимических показателей проводили: 1) определение аскорбиновой кислоты (по С.М. Прокошеву): кислотная вытяжка из исследуемого материала оттитровы-вается раствором индикатора - 2,6-дихлорфенол-индофенола - синего цвета до остающейся розовой окраски. По количеству миллилитров пошедшего на титрование индикатора судят о содержании аскорбиновой кислоты (витамина С) во взятой вытяжке; 2) определение дубильных веществ. Метод основан на легкой окисляемости дубильных веществ перманганатом на холоде в присутствии индикатора ‒ индигокармина. Для получения правильного представления о действительном содержании дубильных веществ необходимо произвести аналогичное титрование вытяжек после адсорбции танина активированным углем, желатином, кожным порошком или казеином. По разности их титрований судят об истинном количестве танина; 3) определение жиров путем щелочного омыления. Суть метода состоит в том, что содержащиеся в исследуемом материале жиры омыляются, мыла разлагаются кислотой и образовавшиеся свободные жирные кислоты извлекаются органическим растворителем. Жиры в среднем содержат около 95,7% жирных кислот. Следовательно, умножив количество найденных жирных кислот на коэфициент 1,046, получают количество соответствующего им жира. При исследовании многих растительных объектов требуется предварительная обработка материала 2%-ной соляной кислотой при нагревании с целью разложения легкогидролизуемых полисахаридов; 4) определение клетчатки. Сущность метода: клетчатка извлекается при кипячении в смеси кислот уксусной, трихлоруксусной и азотной; 5) определение белкового азота. При определении азота белки отделяют от других азотистых соединений осаждением 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Затем осадок минерализуют с H2SO4 по Кьельдалю и определяют содержание азота с реактивом Несслера; 6) определение общего азота методом Кьельдаля. Принцип метода состоит в том, что навеску анализируемого материала минерализуют в присутствии концентрированной H2SO4, в результате чего все органические вещества окисляются, а выделяющийся аммиак связывается серной кислотой. Определяют азот с реактивом Несслера; 7) определение сырого жира. Принцип метода: растительный материал обезвоживают и извлекают жир каким-либо растворителем (этиловый эфир, бензин, бензол и др.). Чем ниже температура кипения растворителя, тем легче его удалить после экстракции жира. Извлеченный сырой жир освобождают от растворителя и взвешивают; 8) определение редуцирующих сахаров. Принцип метода: для анализа используют Фелингову жидкость (смесь медного купороса с сегнетовой солью в щелочной среде). В присутствии сегнетовой соли в щелочной среде образуется комплексное соединение. При взаимодействии раствора сахара с феллинговой жидкостью сахар окисляется и образуется закись меди. По количеству образовавшейся закиси меди можно судить о содержании сахара в растворе.

Результаты исследования

Фитомелиорирующая роль растений при высоких дозах удобрений

В настоящее время вопросы баланса химических элементов на нефтезагрязненной почве приобретают все большее значение. Имеющиеся работы [9, 10] свидетельствуют о значительных колебаниях в величинах выноса (N ‒ 4-35 кг/га, P 2 O 5 2-25кг/га, K 2 O 6-90 кг/га). В связи с этим была поставлена цель установить величины выноса питательных веществ сельскохозяйственными культурами из среднесуглинистой светло-каштановой почвы при нефтяном загрязнении и под влиянием NPK удобрений (табл. 1). Однако литературные данные, характеризующие вынос питательных веществ культурными растениями в различных климатических условиях, недостаточны.

Вместе с химическими мелиорантами в почву поступают микроэлементы (Fe, Zn, Mn, Cu, B, Co), но для них характерен отрицательный баланс, так как вынос из почвы преобладает над поступлением. Поэтому в производственных условиях на данном этапе при сложившейся химической мелиорации следует вносить дополнительно в почву микроудобрения.

Комплексные удобрения во всех случаях повысили количество вынесенных зольных элементов и азота, что связано с увеличением урожая зерна. Повышение в зерне содержания N, P, K, Fe и Zn обусловлено значительным увеличением выноса этих элементов урожая. Особенно сильно (на 40% относительно контроля) возрастает вынос фосфора. Доля MgO и

Таблица 1

Вынос элементов питания сельскохозяйственными культурами (трава)

Данные	Урожай,	Сырая зола,	N	Р 2 О 5	Рb	Zn
	ц/га	%	кг / га		г / га
Ячмень
Контроль	17,2	2,30	81,01	22,01	10,0	19,9
Загрязнение	24,1	1,70	38,11	46,85	6,7	13,4
Овес
Контроль	13,0	4,15	86,74	12,64	8,2	13,4
Загрязнение	12,1	6,70	42,74	13,32	6,7	20,7
Амарант
Контроль	24,0	8,75	97,97	79,87	130,0	37,0
Загрязнение	21,0	14,55	151,66	49,45	78,7	74,0
Кресс-салат
Контроль	38,0	5,75	187,93	16,54	9,3	19,5
Загрязнение	35,4	9,65	208,42	19,03	6,7	12,1

СаО в составе золы несколько снижается, что, видимо, связано с интенсивным поступлением в зерно других компонентов. Таким образом, с урожаем зерновых сельскохозяйственных культур выносится почти половина внесенных с удобрениями количеств питательных веществ. Использование удобрений способствует увеличению выноса элементов питания урожая.

На основе полученных данных были построены ряды преобладающих элементов. Элементы по величине выноса расположились в ряд K 2 O>N>P 2 O 5 >Mn.

Биохимическая характеристика растений

В связи с тем, что на участке наблюдения произрастают в близких условиях четыре вида растений, интересно было в ходе вегетации в соответствии с фазами развития растений получить сравнительные межвидовые данные по накоплению в надземной части белков, жиров, углеводов, экстрактивных и дубильных веществ, клетчатки, аскорбиновой кислоты. Динамика накопления изучаемых первичных и вторичных метаболитов у четырех видов сельскохозяйственных растений оказалась различной.

Полученные опытные данные показывают, что на уровень накопления биологически активных веществ представителями разных видов существенное влияние оказывают условия произрастания, которые имеют большее значение, чем видовые особенности. Для овса максимальное содержание сырого протеина (мг/г сырья) установлено в фазу активного роста. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Биохимические показатели растительных образцов

Названия растений	Сырой протеин, %	Сырой жир, %	Редуц. сахара, %	Клетчатка, %	Дубил. в-ва, %	Аскорб. к-та, мг %
Овес + удобрения + нефть	6,95	2,5	3,85	15,9	6,75	0,050
Овес + удобрения + контроль	8,66	2,0	2,40	44,7	11,05	0,042
Ячмень + удобрения + нефть	5,75	3,6	2,11	29,4	9,65	0,080
Ячмень + удобрения + контроль	8,10	2,0	4,11	35,3	7,17	0,069
Кресс-салат + удобрения + нефть	8,40	1,8	3,85	45,1	6,95	0,550
Кресс-салат +удобрения + контроль	9,40	2,3	4,10	25,6	5,40	0,095
Амарант + удобрения + нефть	6,12	1,7	8,81	30,3	2,50	0,050
Амарант + удобрения + контроль	7,37	4,0	7,85	28,8	3,45	0,077

Содержание клетчатки было максимальным в фазу созревания (мг/г сырья). К концу вегетации оба показателя снижались. Ячмень развивался значительно быстрее. В первый срок отбора растения этого вида уже вступили в фазу созревания. В эту пору в них выявлено наибольшее содержание клетчатки (мг/г сырья), тогда как максимальное содержание дубильных веществ выявлено в фазу окончания роста (мг/г сырья). К концу вегетации содержание дубильных веществ, клетчатки, жиров, углеводов снижалось. У кресс-салата изменения в содержании дубильных веществ, клетчатки, жиров, углеводов происходит волнообразно: снижение в период начала цветения, но к началу плодоношения эти показатели достигли максимума. Для амаранта изменения содержания изученных соединений происходят так же, как и у ячменя, но концентрации значительно выше ‒ в 1,5-2 раза. Различия в динамике изучаемых первичных и вторичных метаболитов, вероятно, обусловлены разной продолжительностью фаз и темпов сезонного развития у изучаемых видов, так как условия произрастания равные: для амаранта наиболее продолжительной является фаза активного роста, а для кресс-салата ‒ фаза цветения.

На интенсивность процессов накопления биологически активных веществ сильнее оказывает влияние нефтяное загрязнение почв. При нефтяном загрязнении почв произошли изменения в содержании клетчатки: для овса ‒ уменьшение на 28%, у ячменя ‒ уменьшение на 6, для кресс-салата ‒ увеличение на 20, у амаранта ‒ на 1%, но после 50% разрушения нефти содержание клетчатки у него увеличилось на 13%. Содержание дубильных веществ уменьшилось для овса на 4,3%, кресс-салата ‒ на 1,5, амаранта ‒ 1,0-6,0%. Увеличилось содержание дубильных веществ у ячменя на 2,0%, на следующий год содержание дубильных веществ приблизилось к контролю.

Одним из показателей биологической активности растений является содержание аскорбиновой кислоты. Этот показатель является одним из самых чувствительных. В сравнении с контролем у овса практически не произошло изменений, у ячменя содержание аскорбиновой кислоты уменьшилось в 3 раза, у кресс-салата ‒ в 2, у амаранта ‒ в 1,5 раза.

Проведенные исследования выявили общую зависимость в действии анионных форм на углеводный обмен опытных культур. Имеющие место некоторые отклонения обусловлены биологической спецификой растений. Неблагоприятное действие данного аниона наиболее резко проявилось на углеводном обмене овса, в траве которого количество сахаров сильно упало по сравнению с другими культурами.

Как видно из таблицы 3, анионы оказывают неодинаковое и существенное влияние на содержание сахаров в траве растений. Так, хлор способствует снижению количества сахаров у всех опытных культур, причем уровень сахаров падает по мере повышения концентрации аниона в питательной среде.

Таблица 3

Влияние анионов почвы на биохимический состав растений*

Культура	мэкв/100 г почвы		Редуцир. сахара, %	Сырой протеин,%	Cухое вещество,%
	Cl	SO 4
Амарант	8,0 7-10	7,34 7,3-11,4	3,85 3,81-3,93	7,37_ 5,49-6,16	18,0 19,2
Ячмень	6,0 5-8	9,4 5,8-8,0	4,11 2,11-3,83	8,10_ 5,75-6,70	23,0 21,9
Овес	7,0 9,0	5,5 8,6	2,4 3,85	8,66_ 6,95	27,1 2;.8
Кресс-салат	8,0 7,0	7,2 7,0	4,1 3,85	9,4_ 8,4	21,0 18,2

* в числителе ‒ в контроле, в знаменетеле – в почве+нефть

Хлор не только ослабляет синтетические процессы сложных углеводов, но и снижает накопление растениями сухого вещества. Возможно, хлор тормозит и отток углеводов из листьев, на что указывает низкое содержание их в репродуктивных органах. Накопление моносахаров в листьях создает неблагоприятные условия для фотосинтеза, а следовательно, для дальнейшего образования полисахаров. Снижение под влиянием хлора содержания углерода в зеленых листьях, особенно значительное на фоне его повышенных концентраций при нефтяном загрязнении, может свидетельствовать об угнетении фотосинтетической способности.

При снабжении растений сульфат-ионами углеводный обмен носит совершенно иной характер. Сульфат способствует синтезу сахаров в листьях всех опытных культур, так как усиливая биосинтез углеводов, несколько снижает уровень редуцирующих сахаров, он способствует их превращению в полисахара. Положительно влияет SO 4 -ион и на синтез белковых веществ. Можно предположить, что SO 4 -ион повышает интенсивность фотосинтеза путем активизации синтетических процессов и усиленного использования моносахаров, тем самым, сдвигая реакцию в сторону дальнейшего использования гексоз, улучшая сульфатами и карбонатами углеводный обмен растений [11], но есть высказывания и противоположного порядка [12]. Избыточные концентрации сульфат иона, аналогично хлору, тормозят синтез углеводов и отток их из листьев к репродуктивным органам в период созревания зерна, тем самым снижая фотосинтетическую активность листьев.

Выводы

• 1.    Установлены величины выноса питательных веществ сельскохозяйственными культурами из почвы при нефтяном загрязнении и под влиянием NPK-удобрений. Исследованы биохимические изменения в растениях-фитомелиорантах под воздействием нефтяного загрязнения.

• 2.    Выявлены фитотоксические свойства нефтезагрязненных почв. Изучено негативное влияние нефтяного загрязнения на биологические показатели растений.

• 3.    В сравнительных условиях определены уровни накопления, а также изменчивость биохимического состава четырех видов сельскохозяйственных культур, произрастающих в одинаковых почвенно-экологических условиях на нефтезагрязненных почвах.

• 4.    Анионный состав удобрений оказывает существенное влияние на обмен углеводов в растениях. Хлор ухудшает углеводный обмен, его отрицательное действие усиливается по мере повышения концентрации.