Биохимические параметры интенсивности системной воспалительной реакции в оценке биосовместимости скаффолдов на основе поликапролактона и ватерита

В настоящее время одним из важнейших направлений медицины, в частности, травматологии и ортопедии, является создание композитных материалов, представляющих собой трёхмерные пористые структуры, которые позволяют решить проблему замещения утраченных тканей, а также моделировать биомеханические свойства имплантируемой конструкции, что является одним из ключевых моментов тканевой инженерии. Для стимуляции регенерации костной ткани перспективным представляется использование различных материалов с высокой степенью механической прочности, устойчивости, способно- стью к управляемой биорезорбции [1, 2]. Одним из таких синтетических материалов является поликапролактон, который обладает хорошими адгезивными, пролиферативными свойствами и способен к медленной деградации в организме реципиента [3]. Кроме того, учитывая высокую степень минерализации межклеточного вещества для структурного восстановления участка поврежденной ткани включают ватерит, обладающий высокой способностью к пролиферации и дифференцировки остеобластов [4]. Важным условием, предъявляемым к скаффолдам, является их биологическая совместимость, то есть способность к заселению клетками и васкуляризации, отсутствие иммунологического отторжения. Сроки биодеградации матриксов должны быть сопоставимы со сроками регенерации костной ткани, а продукты их биологического разложения не должны оказывать токсического воздействия на организм [5, 6]. Одним из патогенетических аспектов биологической совместимости матриц является интенсивность проявлений локальной воспалительной реакции, возникающей при субкутанных имплантационных тестах у крыс [7]. Представляется актуальным изучить уровни некоторых провоспалительных цитокинов, белка острой фазы в сыворотке крови при подкожной имплантации поликапролактоновых скаффолдов, минерализованных ватеритом для оценки выраженности системного воспалительного ответа.

Цель: выявить значимые изменения маркеров системного воспалительного ответа для оценки биологической совместимости скаффолдов на основе поликапролактона и ватерита.

Материалы и методы

Для осуществления эксперимента проводили разрез предварительно депилированной и обработанной антисептиком кожи межлопаточной области крыс. Далее скаф-фолд в форме диска диаметром 10 мм имплантировался в подкожно-жировую клетчатку, после чего в третьей и четвертой группах на рану накладывались швы. Животным второй группы проводилось полное по объёму хирургическое вмешательство, но без имплантации скаффолда. На 7-е и 21-е сутки после имитации имплантации матриц у ложнооперированных животных под наркозом проводился забор крови путём пункции правых отделов сердца. Забор крови осуществлялся в пробирки Vacuette в объёме 5 мл с активатором свёртывания и разделительным гелем. Для получения сыворотки крови производили центрифугирование при 3000 об/мин 600 секунд, после чего полученные образцы замораживали и хранили при температуре -20 °С. Выведение животных из опыта осуществляли путём передозировки препаратов для наркоза.

Для оценки системного воспалительного ответа проводилось определение в сыворотке крови экспериментальных животных концентраций фактора некроза опухоли -альфа (ФНО-а), интерлейкина-1-бета (ИЛ-1в) и С-реактивного белка (СРБ) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов реактивов « IL-1β rat », « TNF-α rat » и « Rat C-Reactive Protein ELISA » ( eBioscience, Invitrogegen by Thermo Fisher Scientific , США). ИФА выполнялся на микропланшетном спектрофотометре An-thos 2020 ( Biochrom , Великобритания).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи пакета программ Statistica 10.0. Большинство наших данных не соответствовало закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовался U -критерий Манна-Уитни, на основании которого рассчитывали Z -критерий и показатель достоверности различия p. Различия считали значимыми при р < 0,05.

Результаты

Для оценки системных проявлений воспалительной реакции в организме белых крыс проводилось сопоставление концентраций провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1в) и СРБ в сыворотке крови, забранной на 7-е и 21-е сутки эксперимента у животных групп сравнения, отрицательного контроля и опытной группы с аналогичными показателями интактной группы.

В результате проведённых исследований установлено, что у ложнооперирован-ных животных на 7-е сутки исследования не отмечается статистически значимых изменений концентрации изученных провоспа-лительных цитокинов (р > 0,05) в сыворотке крови, однако, зафиксировано статистически достоверное повышение содержания СРБ в 1,19 раз (р < 0,05) в сыворотке крови по сравнению с животными контрольной группы. К 21-м суткам исследования концентрации ФНО-а, ИЛ-1в и СРБ в группе сравнения не имели статистически значимых отличий от уровня изучаемых параметров у интактных крыс (р > 0,05), однако, отмечено снижение уровня СРБ по сравнению с данными, полученными на 7-е сутки эксперимента (р < 0,05) (табл. 1).

У животных группы отрицательного контроля через 7 суток после имплантации скаффолдов, не обладающих биосовместимостью, по отношению к данным группы интактных животных концентрации ФНО-а, ИЛ-1в статистически значимо повышались в 1,69 раз (р < 0,05) и в 1,79 раз (р < 0,05); по сравнению с данными группы ложноопери-рованных животных уровни ФНО-а и ИЛ-1в статистически достоверно увеличились в 2,01 раз (р < 0,05) и в 1,91 раз (р < 0,05). Содержание СРБ повысилось в 1,66 раз (р < 0,05) как по сравнению со значениями, зарегистрированными у группы контроля, так и в 1,39 раз (р < 0,05) по отношению к данным группы сравнения. На 21-е сутки эксперимента по сравнению с контрольными значениями зафиксировано статистически достоверное повышение уровней ФНО-а, ИЛ-1в в 1,65 раз (р < 0,05) и в 1,71 раз (р < 0,05); по отношению к группе сравнения концентрации ФНО-а и ИЛ-1в статистически достоверно увеличились в 2,18 раз (р < 0,05) и 1,85 раз (р < 0,05), кроме того, по сравнению с данными, полученными на 7-е сутки эксперимента статистически достоверных изменений не обнаружено. Уровень СРБ по сравнению со значениями группы контроля статистически достоверно повысился в 1,26 раз (р < 0,05), по сравнению с данными группы ложнооперированных животных в 1,18 раз (р < 0,05), кроме того, зафиксировано снижение уровня СРБ в 1,32 раз (р < 0,05) по сравнению с данными, полученными на 7-е сутки эксперимента.

Таблица 1

Концентрация маркеров системного воспалительного ответа в сыворотке крови экспериментальных животных

У белых крыс опытной группы на 7-е сутки не отмечено статистически достоверного повышения содержаний изученных цитокинов (р > 0,05) в сыворотке крови как по сравнению с контролем, так и по отношению с данными группы сравнения (р > 0,05), кроме того, по сравнению со значениями группы отрицательного контроля зафиксировано снижение данных показателей в 1,75 раз (р < 0,05) и в 1,79 раз (р < 0,05). В эти же сроки концентрация СРБ статистически достоверно увеличилась в 1,25 раз (р < 0,05) в сыворотке крови по сравнению с данными контрольной группы, снизилась в 1,33 раз (р < 0,05) по сравнению с данными группы отрицательного контроля, кроме того, отсутствуют статистически достоверные различия по отношению к значениям группы сравнения. На 21-е сутки после имплантации скаффолдов из поика-пролактона и ватерита содержание ФНО-α, ИЛ-1β и СРБ (р < 0,05) в сыворотке крови не имеет отличий от такового у крыс групп сравнения и контроля (р < 0,05). Кроме того, нами обнаружено снижение уровней ФНО-α в 2,07 раз (р < 0,05), ИЛ-1β в 1,66 раз (р < 0,05) и СРБ в 1,20 раз (р < 0,05) в сыворотке крови крыс по сравнению с данными группы отрицательного контроля (табл. 1).

Обсуждение

Полученные нами данные демонстрируют, что при имитации имплантации матрицы отсутствие изменений уровней про-воспалительных цитокинов и слабо выраженные изменения содержания СРБ в сыворотке крови можно объяснить незначительными системными проявлениями реакций, происходящих в очаге воспаления, что связано с травматическими повреждениями при оперативном вмешательстве.

Проведённые нами исследования об изменении содержания провоспалительных цитокинов и СРБ в сыворотке крови белых крыс при подкожной имплантации матриц, содержащих нативный овальбумин, совпадают с мнением исследователей о том, что стабильное увеличение концентрации СРБ в сыворотке крови связано с продукцией в ответ на чужеродный белок исследуемых про-воспалительных цитокинов, которые являются основными стимуляторами синтеза данного маркера в печени. Выраженное повышение уровней провоспалительных цитокинов и белка острой фазы в сыворотке крови с 7-х по 21-е сутки наблюдения является подтверждающим фактом развития системной воспалительной реакции, оказывающей влияние на организм в целом [8].

При имплантации скаффолдов из поликапролактона и ватерита, зафиксированное нами отсутствие изменений уровней ФНО-α, ИЛ-1β в сыворотке крови, повышение концентрации СРБ на 7-е сутки исследования, вероятно, может свидетельствовать о реакции окружающих мягких тканей в ответ на механическую травму при импланта- ции скаффолда [9, 10]. У животных этой же группы снижение уровней изучаемых показателей в сыворотке крови на 21-е сутки по сравнению с группой отрицательного контроля в очередной раз подтверждает факт того, что имплантация данного вида композитного матрикса не вызывает возникновения интенсивной воспалительной реакции, а также участвует в структурном замещении дефекта и стимуляции остеогенеза.

Заключение

У белых крыс опытной группы отсутствие статистически значимых изменений уровней ФНО-α и ИЛ-1β на 7-е и 21-е сутки исследования, незначительное повышение уровня СРБ на 7-е сутки в сыворотке крови свидетельствует о слабовыраженной непродолжительной воспалительной реакции, что является патогенетической составляющей биосовместимости скаффолдов на основе поликапролактона и ватерита.