Биокаталитический синтез оптически чистых сульфоксидов

Оптически активные (энантиомерно однородные, хиральные) сульфоксиды находят широкое применение в химической и фармацевтической практике. Получение оптически чистых сульфоксидов осуществляется в основном методами химического синтеза [Mata, 1996]. При использовании химических методов для получения хиральных сульфоксидов не всегда достигается высокая энан-тиоселективность реакций [Толстиков, Гришко, Ившина, 2003].

Альтернативой многостадийному химическому синтезу оптически активных соединений выступают биологические технологии, позволяющие существенно повысить уровень регио- и стереоселективности реакций. В качестве эффективных биокатализаторов процесса окисления прохиральных органических сульфидов используются ферментные препараты (окисигеназы, пероксидазы) [Zhang, Li, Xu, 2010; Ceccoli, Bianchi, Rial, 2014] и целые микробные клетки [Biotransformation ..., 2003; Isolation ..., 2009; Enantioselective ..., 2013; Highly ...,2013].

Оптически активные сульфоксиды

Оптически чистые сульфоксиды — соединения, обладающие широким спектром биологических свойств, начиная от вкусовых и ароматических предшественников до проявления антимикробной, противогрибковой активности [Fernandez, Khiar, 2003; Bently, 2005]. Биологически активные сульфоксиды обнаружены в составе экстрактов лука, чеснока, растений сем. Крестоцветные (горчица, редис, двояко плодник). Хиральную сульфоксидную группу содержит полифункциональный антибиотик спарсомицин - продукт жизнедеятельности стрептомицетов Streptomyces sparsogenes [Толстиков, Гришко, Ившина, 2003].

Энантиомерно чистые сульфоксиды широко используются в качестве высокоэффективных фармаконов и экологически безвредных инсектицидов. Среди современных лекарственных средств, действующим началом которых являются хиральные сульфинилсодержащие соединения, можно отметить противоязвенные (пантопразол, рабепра-зол, лансопразол, омепразол, тенатопразол) и ноотропные (армодафинил) препараты, эффективность которых обусловлена различием в скорости метаболизма (S)- и (/^-сульфоксидов [Drug interaction ..., 2001; McConathy, Owens, 2003; Armodafinil ...,2011].

В настоящее время хиральные органические соединения находят свое применение в качестве стереонаправляющих групп или хиральных строительных блоков для синтеза сложных по структуре фармацевтических препаратов [Synthesis ..., 2011; Cationic ..., 2013]. В асимметрическом синтезе сульфоксидная группа служит в качестве активного центра, способного с высокой стереоселективностью контролировать реакции алкилирования или конденсации карбанионов с последующим восстановительным удалением RS(O)-rpynnbi при синтезе насыщенных соединений; введения, а затем удаления RS(O)-rpynnbi в виде сульфеновой кислоты при синтезе олефинов; циклоприсоединения и альдольной конденсации [Сагеио, 1995; Прилежаева, 1998].

Биокаталитический синтез оптически активных сульфоксидов с использованием целых клеток микроорганизмов

Биологический синтез оптически активных сульфоксидов может проводиться путем асимметрического окисления прохирального сульфида с образованием оптически чистого (8)- или (7?)-сульфоксида и кинетического разделения рацемической смеси (5)- и (7?)-изомеров [Synthesis ..., 2011] (рис. 1).

Эяшисмер! Э-внтимр2

Рис. 1. Способы получения оптически чистых сульфоксидов

Возможность практической эксплуатации биологических катализаторов с целью трансформации прохиральных сульфидов показана в многочисленных работах [Holland, 2001; Fernandez, Khiar, 2003; Biocatalytic ..., 2006; Isolation ..., 2009; Resolution ...,2011; Zhang, Li, Xu, 2010; Protein engineering of nitrobenzene ..., 2013]. В качестве катализаторов процесса сульфоксидирования используются как индивидуальные ферменты [Zhang, Li, Xu, 2010; Ceccoli, Bianchi., Rial, 2014], так и целые микробные клетки [Biotransformation ..., 2003; Isolation ..., 2009; Enantioselective ..., 2013].

Перспективность использования целых клеток микроорганизмов в качестве биокатализаторов процесса синтеза оптически чистых соединений обусловлена тем, что спектр метаболизируемых ими веществ намного шире естественных субстратов отдельных ферментов [Synthesis ...,2011]. Исследования по биологической трансформации органических сульфидов в сульфоксиды проводятся преимущественно с использованием мицелиальных грибов [Biotransformation ..., 2003; Pinedo-Rivilla, Aleu, Collado, 2007; Stereoselective biotransformations .... 2009; Aspergillus genus ..., 2013], дрожжей [Oxidative ..., 1995; Bakers' yeast ..., 1995], бактерий [Biotransformation ..., 2003; Opposite enantioselectivi-ties ..., 2005; Isolation ..., 2009; Enantioselective ..., 2013; Stereoselective oxidation ..., 2014], также описаны единичные примеры с использованием микроводорослей [Daligault, Niguer-Chauvin, Patin, 2006].

Способность к биотрансформации арилалкил-сульфидов и бензотиофена обнаружена у грамотри- цательных бактерий родов Acineiobacter, Pseudomo nas, Streptomyces. Так, мутант почвенных псевдо-

^^ад Pseudomonas putida UV4, содержащий активную толуолдиоксигеназу, катализирует окисление тиоанизола с образованием соответствующего (7?)-фенилметилсульфоксида с оптической чистотой >90% [Toluene ..., 1998; The oxidation ..., 2013]. Показано, что Р. montelii ТВ-1 катализирует образование (7?)-ар ил алкиловых сульфоксидов с химическим выходом 55-99% и энантиоселективностью 63-99% [Stereoselective oxidation ..., 2014]. В работе M.L. Mascotti с соавт. ^Aspergillus genus ..., 2013] впервые описаны эксперименты по биотрансформации алкил-и диалкилсульфидов с использованием Streptomyces phaeochromogenes NCIMB 11741, X flavogriseus ATCC33331, S. hiroshimensis ATCC 27429. Несмотря на то, что полученные сульфоксиды зачастую обладали высокой оптической чистотой, химический выход их был незначительным (до 50%).

Высокой сульфидокисляющей активностью характеризуются актинобактерии родов Gordonia и Rhodococcus. Клетки Gordonia terrae ИЭГМ 136 и

Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66 катализируют образование (7?)- и (б)- арилалкилсульфоксидов с энантиоселективностью 85 и 95% соответственно

[Елькин, Гришко, Ившина, 2010; Enantioselective ..., 2013]. С использованием клеток Rhodococcus sp. ECU0066 детально исследован механизм образования (8)-энантиомернооднородного сульфоксида из метилфенилового сульфида путем селективного окисления (7?)-изомера в сульфон [Isolation ..., 2009] (рис. 2).

(S)-сульфоксид

Рис. 2. Схема биотрансформации метилфенилового сульфида штаммом Rhodococcus sp. ECU0066

Описаны примеры синтеза энантиомерно однородных сульфоксидов путем асимметрического окисления рацемического метилфенилового сульфоксида с использованием представителей рода Rhodococcus. Недостатком данной методики является низкий целевой выход образующихся сульфоксидов, так как при этом 50% сульфоксида трансформируется в сульфон. Сульфоксиды по сравнению с сульфидами обладают меньшим токсическим действием на живые клетки, вследствие чего становится возможным использование более высоких концентраций рацемического сульфоксидного субстрата [Isolation ..., 2009; Sequential racemization ...,2012].

При окислении сульфидов культурами мицел-лиальных грибов показано, что не существует строгой корреляции между видовой принадлежностью и их способностью к биотрансформации сульфидов. В работе H.L. Holland [2001] описан синтез (Ry сульфоксидов с высокой оптической чистотой с помощью коллекционной культуры мицелиального гриба Mortierella isabellina АТСС 42613. Грибы рода Aspergillus катализируют окисление различных арилалкиловых сульфидов с образованием (Ry сульфоксидов с высокой энантио-селективностью (ее 100%) (Aspergillus genus ..., 2013]. Y. Yamazaki с соавт. [Stereoselectivity of microbial ..., 1996] проведено стереоспецифическое окисление металлоценовых сульфидов культурой М. isabellina DSM 1414. При этом получены соответствующие сульфоксиды с оптической чистотой от 86.4 до 96.6% и химическим выходом 48-73%. Описаны единичные примеры успешного использования дрожжей Saccharomyces cerevisiae в реакциях окисления тиоанизола, его иора-замещенных производных и бензилалкилсульфидов [Oxidative ..., 1995; Bakers'yeast..., 1995].

Биокаталитический синтез оптически активных сульфоксидов с использованием индивидуальных ферментов

Известно, что для асимметрического окисления прохиральных сульфидов могут быть использованы ферменты, относящиеся к классам оксигеназ и пероксидаз. Диоксигеназные ферменты из почвенных бактерий Р. putida - толуолдиоксигеназы (ТДО) и нафталиндиоксигеназы (НДО) катализируют образование оптически активных алкиларил-и алкенарилсульфоксидов с ее 90%. Применение ТДО приводит преимущественно к образованию сульфоксидов с (/^-конфигурацией, в то время как при взаимодействии субстрата с НДО образуются исключительно (5)-энантиомеры [Lee, Brand, Gibson, 1995]. Описана возможность получения энантиомерно обогащенных (5)-энантиомерных фе-нилметил- и и-толилметилсульфоксидов (>99% ее) с помощью субстратспецифичной монооксигеназы из бактериальных клеток Р. fluorescens [Substrate ..., 2003]. ФАД-зависимая циклогексанонмонооксигеназа катализирует процесс асимметрического окисления диалкил-, фенилалкил-, бензилалкил- и замещенных бензилалкилсульфидных субстратов в энантиомерно обогащенные сульфоксиды с ее до 99% [A widely ..., 1981].

Наряду с оксигеназами для биотрансформации органических сульфидов возможно использование пероксидаз. Показано, что полная конверсия тиоанизола в соответствующий (5)-сульфоксид при участии пероксидазы хрена достигается при усло вии постепенного введения Н2О2 в реакционную среду (60% ее) [Recent ..., 1999). Гемсодержащий фермент хлорпероксидаза способна катализировать Н2О2-зависимый процесс окисления органических сульфидов. В качестве продуктов данной реакции образуются (ЛЬ-сульфоксиды с химическим выходом от 33 до 100% и оптической чистотой 19-91%. Для получения оптически чистых сульфоксидов используются также ванадий-зависимые бромпероксидазы, которые катализируют окислительное галогенирование органических соединений через образование пероксида металла [Recent..., 1999].

В настоящее время ряд публикаций посвящен исследованиям по повышению эффективности и стабильности биокатализаторов, включающим применение иммобилизованных микробных клеток; введение дополнительных ростовых субстратов; культивирование бактерий в двухфазных системах; разработку генетически модифицированных биокатализаторов [Елькин, Гришко, Ившина, 2010; Protein engineering of toluene ..., 2008; The oxidation 2013; Protein engineering of nitrobenzene

2013; Development ..., 2013]. Так, J. Shainsky с соавт. [Protein engineering of nirobenzene ..., 2013] использовали нитробензолдиокисигеназу, выделенную из Comamonas sp., для окисления различных пара-замещенных арилалкиловых сульфидов. Методом сайт-направленного мутагенеза удалось повысить эффективность данного фермента для направленного окисления сульфидов более чем в 10 раз. J.-D. Zhang с соавт. [Sequence analysis ..., 2010] проводили успешные эксперименты по биотрансформации арилалкильных сульфидов с конверсией от 70 до 95% и энантиомерным избытком 80-100%, используя рекомбинантную Р450-зависимую монооксигеназу (таблица).

Окисление сульфидов (Ri-S-R₂) в сульфоксиды индивидуальной Р450-зависимой монооксигеназой из Rhodococcus sp. ECU0066

Ri	r2	Конверсия, (%)	ее, (%)*	Конфигурация
СР.	СНз	17.8	86.5
Р- сн3-СбН5	СНз	68.7	87.0
р- СН3О-СН.	СНз	83.5	63.5
р-р- GH.	СНз	37.4	90.0
/>С1-СбН5	СНз	88.6	99.0
СИ.	С2Н5	31.8	99.0

Примечание. *ее-энантиомерный избыток. Дит. по Sequence analysis ..., 2010.

Рекомбинантная 4-ацетофенон монооксигеназа, выделенная из Pseudomonas fluorescens АСВ, была использована G. de Gonzalo с соавт. [Biocatalytic .2006] для получения арилалкиловых сульфоксидов с высоким выходом и оптической чистотой. Так был получен сульфоксид тиоанизола с 99%-ной энантиоселективностью и степенью конверсии 96%. Показана возможность коэкспрессии генов формиатдегидрогеназы из Candida boidinii и циклогексанонмонооксигеназы из Acinetobacter cal-coaceticus NCIMB 9871 в Escherichia coli, что позволило сконструировать рекомбинантный штамм, способный синтезировать (Л)-сульфоксиды с высокой энантиоселективностью (ее 99%) [Development 2013].

Применение двухфазных систем для биотрансформации органических сульфидов позволяет использовать более высокие концентрации субстрата и обеспечивает защиту живых бактериальных клеток от его токсического влияния [Klibanov, 2003; Biocatalytic ..., 2006; Resolution ...,2011; Highly ..., 2013]. Y.-C. He с соавт. [Highly ..., 2013] путем биотрансформации метилфенилового сульфида в двухфазной системе октан-вода клетками Rhodococcus sp. CCZ10-1 удалось получить 118 ммоль целевого (8)-сульфоксида с высокой энантиоселективностью (ее 99.9%).

Заключение

Перспективность использования оптически активных сульфоксидов в химической и фармацевтической промышленности обусловливает поиск высокоэффективных биокатализаторов для стереосе-лективного окисления прохиральных сульфидов.

В последнее время исследования по биокатали-тическому синтезу энантиомерно чистых сульфоксидов развиваются довольно интенсивно [Stereoselective biotransformations ..., 2009; Aspergillus genus ..., 2013; Enantioselective ..., 2013; The oxidation ..., 2013; Protein engineering of nitrobenzene ..., 2013; Stereoselective oxidation ..., 2014]. Несмотря на высокую эффективность использования чистых ферментных препаратов в реакциях энантиоселективно-го сульфоксидирования, проблемы выделения и обеспечения стабильности ферментов ограничивают их использование в практике. Указанные недостатки позволяют не применять целые микробные клетки, многочисленные примеры успешного использования которых представлены в литературе [Holland, 2001, Biotransformation ..., 2003; Enantioselective ..., 2013; Highly ..., 2013; Development ..., 2013]. При этом биокатализаторы на основе целых клеток перспективны в синтезе более структурно сложных молекул, а именно таких фармакологически значимых сульфинилсодержащих соединений, как (8)-омепразол или (7?)-модафинил [Fernandez, Khiar, 2003; Olivo, Lozada, 2009; Whole-cell..., 2011].

Анализ литературных данных свидетельствует о возрастающем спросе современных методов генной инженерии для регуляции эффективности биоката-литических процессов синтеза оптически чистых сульфоксидов [Protein engineering of toluene ..., 2008; The oxidation ..., 2013; Protein engineering of nitrobenzene ..., 2013; Development..., 2013].