Биологическая полноценность эпидидимального семени зубра (Bison bonasus L.) при криоконсервации и длительном хранении

В настоящее время один из глобальных вызовов человечеству — задача сохранения флоры и фауны (1, 2). Вследствие неблагоприятной экологической обстановки, техногенных, экономических и других факторов, большинство из которых носят антропогенный характер, некоторые виды находятся под угрозой исчезновения. Доказано, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов, следовательно, сохранение биоразнообразия — единственный механизм обеспечения стабильности жизни на Земле (3, 4). Кроме того, при высокой скорости роста численности населения и ограниченности ресурсов серьезной проблемой становится обеспечение продуктами питания и сырьем для легкой промышленности. Ее эффективное решение — выведение высокопродуктив-

* Исследования выполнены при финансовой поддержке программы Президиума РАН ¹ IV.13.3.

ных пород и одомашнивание диких видов животных. Генетическое разнообразие исходного материала влияет на успех селекции: длительный отбор сопровождается увеличением гомозиготности, что, в свою очередь, приводит к ряду нарушений — к снижению резистентности, появлению наследственных заболеваний и т.д. Для повышения гетерезиготности часто требуется интродукция нового генетического материала, источником которого могут служить дикие сородичи домашних животных (5-9).

Существуют две основных стратегии сохранения генофонда: in situ (содержание видов в естественной среде обитания или пород домашних животных в условиях выведения) и ex situ (сохранение компонентов биологического разнообразия вне их естественных мест обитания, например в питомниках, зоопарках и т.д., или посредством криоконсервации генетического материала). Метод in situ предполагает разведение и содержание животных и птиц в специальных генофондных хозяйствах и экономически затратен. Метод ex situ имеет важное значение для видов, реинтродукция которых в ближайшем будущем не представляется возможной (10-14). Во многих странах сохранение ex situ — неотъемлемая часть стратегии охраны окружающей среды (15). В зависимости от цели и задачи биологическим материалом для криоконсервации могут быть эмбрионы, ткани животных, мужские (спермии), женские (яйцеклетки) половые клетки (16-22). Криобанк генетических ресурсов дикой фауны можно использовать для сохранения видов, а также для создания новых селекционных форм и пород.

Зубр ( Bison bonasus L.) — дикий лесной бык, относится к редким исчезающим видам. Это самое крупное копытное животное, единственный дикий вид подсемейства Bovinae , обитающий на Европейском континенте (23-25). В начале XX века вольноживущие популяции зубров были уничтожены. В результате длительной научной и селекционной работы численность зубров с 1927 по 2000 год увеличилась более чем в 70 раз и в настоящее время составляет свыше 3500 тыс. особей; в России обитает около 1500 вольноживущих зубров.

Криоконсервация и искусственная репродукция (in vitro) — методы, которые используются для сохранения и восстановления численности редких видов и рекомендованы к применению Конвенцией о биологическом разнообразии и другими международными документами (26-28). Во Всероссийском НИИ животноводства им. академика Л.К. Эрнста была разработана методика отбора и криоконсервации эпидидимального семени зубра, а также создан криобанк семени зубров популяции Приокско-Террасного и Окского государственных природных биосферных заповедников (29). C использованием криобанка эпидидимального семени зубра получены три поколения гибридных животных: от искусственного осеменения коров черно-пестрой породы семенем зубра родились четыре телочки, и в дальнейшем были изучены гибриды F1 и F2 от разных вариантов скрещивания с молочными (черно-пестрая, голштинская) и мясной (абердин-ангус-ская) породами (30, 31).

Эпидидимальное cемя значительно отличается от эякулированного по морфофункциональным характеристикам. Эпидидимальные сперматозоиды неподвижны, имеют невысокий метаболизм. Подвижность сперми-ев инициируется после эякуляции, в результате чего метаболические процессы активируются. Криорезистентность сперматозоидов с низким метаболизмом выше.

Для криоконсервации сперматозоидов, в том числе извлеченных из эпидидимиса, используют среды, которые усиливают метаболизм. Известно, что последний этап конденсации хроматина в ядре сперматозоидов происходит уже после эякуляции, следовательно, этот показатель в извлеченных из эпидидимиса клетках ниже, чем в эякулированных. То есть вероятность повреждения генетического материала при замораживании-оттаивании в ядрах сперматозоидов, полученных из эпидидимиса, выше, чем в эякулированных (32). Процесс криоконсервации отражается на морфометрических показателях: в результате замораживания-оттаивания уменьшаются размеры сперматозоидов, особенно площадь и периметр головки (3336). Криоконсервация также влияет на ультраструктуру сперматозоидов (37-40). В настоящее время используют две технологии криоконсервации спермы — в пайетах и гранулах.

Мы впервые исследовали влияние криоконсервации и срока хранения на морфометрические и морфофункциональные свойства семени зубров.

Целью представляемой работы было изучение биологической полноценности замороженно-оттаянного эпидидимального семени зубра при длительном (более 20 лет) хранении.

Методика . Начиная с 1998 года, эпидидимальное семя получили от четырех самцов зубра (Приокско-Террасный и Окский государственные природные биосферные заповедники). Отбор осуществляли постмортально из придатка семенника у животных, получивших несовместимые с жизнью травмы или выбракованных (предназначенных для охоты). Содержимое хвоста эпидидимиса извлекали в синтетической среде (гомогенизация) с последующей фильтрацией для освобождения от клеточных примесей. Содержание и подвижность свежеполученных эпидидимальных спермиев в образце определяли по методике оценки качества семени быков-производителей. Семя замораживали в гранулах в соответствии с технологией криоконсервации спермы быков-производителей (41).

Рутинную оценку замороженно-оттаянного семени проводили на основании технологии computer-assisted semen analysis (CASA). Степень фрагментации ДНК изучали в тесте с акридиновым оранжевым (АО-тест) с последующей флуоресцентной микроскопией. Состояние акросом оценивали с помощью Diff Quik окрашивания (42-44).

Подвижность замороженно-оттаянных сперматозоидов определяли с использованием программного обеспечения Зоосперм 1.0 («ВидеоТест», Россия), камеры Маклера (Израиль) и микроскопа Nikon Eclipse Ni («Nikon Corp.», Япония). Подвижность оценивали по средним данным для 3 образцов на основе видеосъемки (продолжительность 1 с) трех полей.

Обработка данных и классификация сперматозоидов проходила в автоматическом режиме на основании следующих показателей: VAP — средняя скорость движения головки по усредненной траектории движения, мкм/с; VSL — скорость прямолинейного движения головки (средняя скорость движения головки сперматозоида вдоль прямого отрезка между начальной и конечной точкой траектории), мкм/с; VCL — средняя скорость движения сперматозоидов по реальной траектории движения, мкм/с; ALH — среднее отклонение головки (амплитуда латерального смещения головки сперматозоида от траектории движения), мкм; BCF — частота колебательных усредненных движений (частота пересечений), Гц; средняя частота пересечения криволинейной траекторией движения сперматозоида его усредненной траектории за единицу времени.

Степень прямолинейности направленного движения сперматозоидов (прямолинейность средней траектории движения, %) рассчитывали по формуле STR = VSL/VAP ½ 100, степень волнистости треков (величина колебания истинной траектории движения по отношению к средней траектории, %) — как LIN = VSL/VCL ½ 100.

В зависимости от перечисленных показателей сперматозоиды разделяли на следующие классы: A — с быстрым прямолинейно-поступательным движением (скорость не менее 25 мкм/с; сперматозоиды этого класса в течение 1 с преодолевали расстояние, равное своей длине); B — с медленным прямолинейным движением (скорость менее 25 мкм/с); C — с манежным или колебательным движением; D — неподвижные.

При изучении морфометрических показателей сравнивали сперматозоиды, полученные от зубров ( n = 4) и быков-производителей голштинской породы ( n = 15) (поскольку получать эякулированное семя от зубров в среде их обитания невозможно, были взяты образцы у их домашних сородичей). Сперму быков-производителей криоконсервировали в пайетах. Срок хранения семени зубров составлял более 20 лет, быков — не более 2 лет.

Данные подвергались математической обработке стандартным методом вариационной статистики в пакете программ Microsoft Exсel. В таблицах приведены средние значения ( Х ) и стандартные ошибки ( х ).

1. Доля (%) сперматозоидов разных классов в         Результаты. Количе- замороженно-оттаянном семени зубров (Bi- ство сперматозоидов с пря-son bonasus L.) (Х±х)                    молинейным поступательным

Кличка зубра	Класс
	А 1	В 1	С 1	D
Мутфиль	10,3±0,2	18,8±0,9	20,3±1,2	50,6±1,6
Авель	8,4±0,1	12,3±0,7	12,1±0,9	67,2±1,8
Морус	6,3±0,2	22,3±0,8	13,2±0,6	58,2±2,1
Мисир	8,3±0,2	13,4±1,2	10,4±0,8	67,9±3,6
Примечан	и е. Описание классов см.		в разделе «Методика».

движением в нативном и за-мороженно-оттаянном семени зависит от множества факторов, таких как индивидуальные особенности особи, вид, возраст, технология кри- оконсервации, используемые разбавители и криопротекторы, метод оттаи- вания (45-47).

2. Морфометрические показатели заморожен-но-оттаянных сперматозоидов зубров ( Bison bonasus L.) и быков-производителей голштинской породы ( Х ± х )

Показатель	1 Зубры ( n = 4) 1 Быки ( n = 15)
Длина сперматозоида, мкм	65,90±1,57	68,3±0,98
Длина головки, мкм	8,46±0,66	9,58±0,28
Ширина головки, мкм	4,72±0,42	4,60±0,12
Периметр головки, мкм	23,95±1,55	24,61±0,36
Площадь головки, мкм2	38,46±1,67	41,6±1,32*
Длина жгутика, мкм * P ≤ 0,05.	57,34±1,96	58,72±0,36

Исследуемые образцы семени значительно различались по содержанию сперматозоидов классов А и В (табл. 1). Основными факторами, которые влияли на активность сперматозоидов, были возраст, индивидуальные особенности зубров и продолжительность хранения семени, поскольку состав среды, тех- нология криоконсервации и оттаивания для всех образцов здесь были одинаковыми. У зубров Мутфиля и Моруса содержание сперматозоидов класса А + В в замороженно-оттаянном семени составляло более 28 %, у Авеля и Мисира неподвижных сперматозоидов было более 67 %, с манежным и колебательным движением — соответственно 12,1 и 10,4 %.

При получении и криоконсервации семени у быков и зубров применялись разные технологии. Эякулированные и извлеченные из эпидидимиса сперматозоиды существенно различались. По всем морфометрическим параметрам, кроме ширины головки, сперматозоиды зубров уступали сперматозоидам быков-производителей. Следует отметить, что различия между группами по изученным показателям не были статистически значимыми, за исключением площади головки сперматозоида: у быков она оказалась на 3,14 мкм2 больше, чем у зубров (табл. 2).

Нами также были изучены органеллы и морфологические структуры спермиев зубров. Аномальное строение сперматозоидов обусловлено генетической компонентой (48), сезонными и экологическими факторами, индивидуальной предрасположенностью

Рис. 1. Доля сперматозоидов с патологической морфологией (А) и поврежденной акросомой (Б) в замороженно-оттаянном семени четырех зубров ( Bison bonasus L.): а — Мутфиль, б — Авель, в — Морус, г — Мисир (сроки хранения семени — более 20 лет).

Рис. 2. Индекс фрагментации ДНК в хроматине сперматозоидов в заморожено-оттаянном семени четырех зубров ( Bison bonasus L.): а — Мутфиль, б — Авель, в — Морус, г — Мисир (сроки хранения семени — более 20 лет).

(49-52), а также возрастом (53-56).

Хроматин — один из важнейших структурных элементов сперматозоидов. Причиной идиопатического бесплодия может быть высокий индекс фрагментации ДНК в хроматине (57-61). Степень фрагментации ДНК в сперматозоидах также зависит от многочисленных биотических и абиотических факторов (62-69).

По содержанию сперматозоидов с нарушенной морфологией и поврежденной акросомой между зубрами обнаружили существенную разницу (рис. 1).

Частота встречаемости сперматозоидов с патологической морфологией была наибольшей у Мисира (14,6 %), наименьшей — у Мутфиля (6,8 %). У последнего частота поврежденных акросом по сравнению с другими зубрами оказалась незначительной и составила 7,2 %.

Индекс фрагментации ДНК в хроматине сперматозоидов существенно различался в изучаемых образцах (рис. 2). Высокая степень фрагментации наблюдалась в сперматозоидах Мисира (более 86 %), меньше всего сперматозоидов с фрагментированной ДНК было обнаружено в образцах, по- лученных от Мутфиля (7 %).

Таким образом, показатели, характеризующие биологическую полноценность сперматозоидов в замороженно-оттаянном семени зубров, хранившемся более 20 лет, зависели от индивидуальных особенностей особей. Содержание сперматозоидов с патологической морфологией варьировало от 6,8 до 14,6 %, степень фрагментация ДНК — от 7 до 86 % Результаты наших исследований продемонстрировали, что методы получения и технология криоконсервации влияют на морфометрические показатели сперма- тозоидов, которые в замороженно-оттаянном эпидидимальном семени ока- зались меньше, чем в эякулированном.