Биологические и генотипические особенности культур стафилококка, выделенных от детей, проживающих в экологически неблагополучном районе города Красноярска

Введение. В связи с техногенным загрязнением окружающей среды отмечается рост числа разных форм дисбиоза у человека. Одной из форм нарушения нормальной микрофлоры является стафилококковое бактерионосительство, которое следует рассматривать как одну из форм инфекционного процесса, с отсутствием клинически выраженных патологических изменений, но с развитием иммунопатологических реакций и антительного ответа [1 , 2]. Носители патогенных стафилококков часто являются основным источником внутрибольничных инфекций. По данным О.В. Бухарина и др., широта стафилококкового носительства иллюстрируется эпидемиологическими наблюдениями, показывающими, что 20 % населения являются резидентными носителями, 70 % – тран-зиторными, и только у 10 % возбудитель постоянно отсутствует.

Детское население в большей степени подвержено воздействию неблагоприятных экологических факторов, причем наиболее чувствительным индикатором в отношении воздействия различных поллютантов, по мнению М.Я. Студеникина, являются дети 8–12 лет [4].

Цель работы. Генетическое типирование с помощью RAPD-ПЦР культур стафилококка, выделенных от школьников младших классов, проживающих в экологически неблагополучном районе города Красноярска.

Материалы и методы. Было обследовано 59 учащихся, проживающих в экологически неблагополучном районе города Красноярска. Уровень загрязнения воздушной среды техногенными факторами оценивали по материалам доклада о санитарно-эпидемиологической обстановке в Красноярском крае (2007 г.).

Обследуемые дети в возрасте 8–9 лет относились к 1-й и 2-й группам здоровья и проживали в данном районе города более 3 лет.

Выделение и идентификацию стафилококков проводили общепринятыми методами [5]. При определении видовой принадлежности штаммов использовали микротесты фирмы «Lachema» (Чехия).

При обследовании школьников на стафилококковый биоценоз исследуемый материал (клетки эпителия слизистой носа) засевали на чашки с желточно-солевым агаром. После инкубировали при 37оС в течение 24–48 часов, затем производили количественную и качественную оценку выросших колоний, расчет показателя микробной обсемененности (ПМО).

Число микробных клеток 103 и более на тампон является показателем высокой обсемененно-сти и свидетельствует о бактерионосительстве, представляющем эпидемическую опасность.

Тип стафилококкового бактерионосительства определяли по антилизоцимной активности (АЛА) штамма. При наличии у золотистых стафилококков АЛА-признака бактерионосителей относили к резидентным [3].

У выделенных штаммов стафилококков определяли факторы вирулентности и персистенции. Факторы вирулентности (гемолитическую активность, продукцию ферментов плазмакоагулазы, лецито-ветиллазы) исследовали по общепринятым методикам [6]. Факторы персистенции – антилизоцимную активность определяли по методике О.В. Бухарина с соавт. Генотипирование выделенных культур золотистого стафилококка проводили методом RAPD-ПЦР со случайным олигонуклеотидным праймером, размером 10 нуклеотидов Sh1 (Short 1) – AATCGGGCTG [7]. Статистический анализ данных выполнялся на персональном компьютере Pentium IV с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0.

Результаты исследования. При бактериологическом исследовании смывов со слизистой носа обследуемых школьников было выделено и идентифицировано 39 культур стафилококков, 20 из них были идентифицированы как S. аureus .

Сравнительные данные по носительству школьниками штаммов S. аureus с факторами вирулентности и персистенции представлены в таблице, из которой следует, что все выделенные штаммы золотистого стафилококка обладали плазмакоагулазной и лицитоветиллазной активностью. У стафилококков наиболее характерным фактором вирулентности является продукция экзотоксина – гемолизина (β-гемолитическая активность) и у 85 % выделенных штаммов этот признак присутствует.

Что касается фактора персистенции – антилизоцимной активности, то АЛА характерна для 85 % изученных культур, причем штаммы, обладающие антилизоцимной активностью, являлись гемолитическими.

Характеристика биологических свойств S. аureus , выделенных от школьников, проживающих в экологически неблагополучном районе г. Красноярска

Номер штамма	Класс, пол обследуемого	Β-гемолитическая активность	Лицитоветиллаза	Плазмакоагулаза	АЛА
1	2 б, жен.	+	+	+	+
2	2 в, жен.	-	+	+	-
3	2 б, жен.	+	+	+	+
4	2 б, муж.	+	+	+	+
5	2 б, муж.	+	+	+	+
6	2 в, жен.	+	+	+	+
7	2 б, жен.	+	+	+	+
8	2 в, жен.	+	+	+	+
9	2 б, жен.	+	+	+	+
10	2 в, жен.	+	+	+	+
11	2 б, муж.	+	+	+	+
12	2 в, муж.	-	+	+	-
13	2 б, муж.	+	+	+	+
14	2 б, жен.	+	+	+	+
15	2 в, жен.	+	+	+	+
16	2 б, муж.	+	+	+	+
17	2 б, жен.	+	+	+	+
18	2 б, жен.	+	+	+	+
19	2 б, жен.	+	+	+	+
20	2 в, жен.	-	+	+	-

Следующим этапом нашей работы являлось генетическое типирование выделенных штаммов стафилококка.

В результате типирования была получена электрофоретическая картина RAPD-ПЦР 20 штаммов S. аureus (рис.1), на основе которых была построена дендрограмма (рис. 2) с помощью программного обеспечения TreeCon. Установлено наличие 6 генотипов среди исследованных 20 штаммов S.aureus.

M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 К+ М

Рис. 1. Генетическое типирование штаммов золотистого стафилококка с помощью RAPD- ПЦР

Общепринято, что если показатель степени генетического родства равен 0,8 и выше, то это характеризует высокую степень генотипического сходства исследуемой выборки штаммов. Если 0,6–0,8 – умеренный; 0,4–0,6 – низкий; если сравниваемые штаммы имеют показатель ниже, чем 0,4, то фактически они являются генотипически неродственными.

В 1-й генотип входили 8 штаммов под № 13, 18, 7, 9, 5, 4, 3, 1 (индекс генетического сходства 1). В результате амплификации образовалось 9 ампликонов длиной от 300 до 1500 нп (нуклеатидные пары) и выше.

У штаммов, относящихся ко 2-му генотипу (№ 16, 17, 19, 11, 14), при изучении электрофоретических профилей выявлены 6 ампликонов длиной от 400 до 1500 нп и выше (гомология 100%).

В 6-й генотип входили 4 изолята (№ 6, 8, 10, 15), которые образовали по 6 ампликонов длиной от 500 до 1500 нп и выше.

Степень генетического родства у 1-го и 2-го генотипов составляет 85 % (т.е. высокая степень генетического родства). У 3-го генотипа степень генетического родства с 1-м и 2-м генотипами составляет 40 % (низкая степень родства).

Рис. 2. Дендрограмма изолятов золотистых стафилококков, выделенных от учащихся младших классов, проживающих в экологически неблагополучном районе города Красноярска

Geristic distance

13 S.aureus

18 S.aureus

7 S.aureus

9 S.aureus     |

1 S.aureus

3 S-лигеиз

4 S.au reus

5 S.aureus

16 S.aureus

17 S.aureus    ц

19 S.aureus

11 S.aureus

14 S.aureus

12 S.aureus    111

20 S.aureus |^

2 S.au reus    ^

6 S.aureus

8 S.aureus   ^|

10 S.aureus

15 S.aureus

Выводы. Таким образом, при анализе полученных результатов следует, что штаммы золотистого стафилококка, относящиеся к 1-му и 2-му генотипу, обладали высокой гемолитической и антилизоцимной активностью и при этом были выделены от учащихся одного класса.