Биологические эффекты кадмия in vivo и in vitro на животную клетку

Оптимальной моделью для изучения механизмов действия кадмия являются виргинские устрицы ( Crassostrea virginica) - типичные представители эстуарий , в мягких тканях которых этот металл накапливается . Проводится большое количество исследований по действию Cd²⁺ как in vivo, так и in vitro, но к настоящему времени нет сравнительных данных по эффекту одинаковых концентраций CdCl₂ на устриц в экспериментах с экспозицией in vivo, так и инкубации клеток с кадмия хлоридом в экспериментах in vitro.

Целью нашего исследования явилось сравнение действия кадмия на ткани [1] и изолированные клетки [2] виргинских устриц Crassostrea virginica .

Материалы и методы . Виргинских устриц ( Crassostrea virginica) , предварительно адаптированных в течение 12-14 суток , разделили случайным образом на две группы . Особи одной группы , содержавшиеся в искусственной морской воде , служили контролем ; другая ( опытная ) группа устриц помещалась в систему аквариумов , содержащих 50 мкг / л кадмия хлорида .

Клетки изолировали из жабер и гепатопанкреаса контрольной группы устриц и инкубировали с 50 мкг / л кадмия хлорида в течение 4 часов .

Концентрация кадмия в тканях и клетках устриц (контроль и опыт) измерялась с помощью атомно-абсорбционного спектрометра AAnalyst 800 (Perkin Elmer). Экспрессию мРНК металлотионеинов проводили с помощью ПЦР в реальном времени, используя LightCycler 2.0 Real Time ПЦР (“Roche applied Science”) и QuantiTect SYBR Green набор для ПЦР (“Quagen”). Экспрессию белков теплового шока определяли методом вестерн блоттинга. Денсиметрический анализ проводили с помощью GelDoc 2000TM System с программой Quality one 1-d Analysis (“BIO RAD”).

Результаты исследований и их обсуждение . Выявлена высокая аккумуляция кадмия жабрами устриц в опытах in vivo ( таблица 1), что противоречит , на первый взгляд , результатам исследований на изолированных клетках , которые показывают достоверно более высокую аккумуляцию этого металла в клетках гепатопанкреаса в условиях in vitro ( таблица 2). Это мы объясняем следующим : во время экспозиции in vivo целого организма с кадмия хлоридом , жабры являются первичным органом соприкосновения с металлом , в то время как аккумуляция кадмия в гепатопанкреасе значительно отставать по времени из - за его переноса от жабер к внутренним органам [3]. Исследования водных организмов показывают накопление высокой концентрации кадмия in vivo в органе , который соприкасается с кадмием раньше и способен к активному обмену ионов , т . е . в жабрах при экспозиции с растворенным в воде кадмия хлоридом и в пищеварительной системе при экспозиции с кадмия хлоридом , смешанным с кормом .

Изолированные клетки гепатопанкреаса устриц аккумулируют больше кадмия ( в 2 раза ), в отличие от клеток жабер , что свидетельствует о более быстром поглощении и длительном удерживании кадмии клетками гепатопанкреаса .

Уровень экспрессии металлотионеинов ( МТ ) также отличался при действии кадмия хлорида in vivo и in vitro. В исследованиях in vivo уровень МТ увеличивался в жабрах в 32 раза , в то время как в гепатопанкреасе увеличивался только в 7 раз , это может отражать роль жабер устриц , как ключевого сайта обмена газов и ионов . Кроме того , они являются одним из первых органов , взаимодействующих с окружающей средой . Металлотионеины с большим количеством сульфидных групп могут выступать как антиоксиданты , взаимодействуя со свободными радикалами , и высокий уровень конститутивно экспрессированных МТ может обеспечить защиту жабер от изменений параметров окружающей среды ( рН , концентрация кислорода в воде ).

При инкубации клеток с кадмия хлоридом уровень экспрессии металлотионеинов увеличивался только в клетках гепатопанкреаса. МТ можно рассматривать как элемент механизма защиты первого ряда, предотвращающий взаимодействие кадмия с критическими клеточными ферментами, структурными белками, ДНК и липидами мембраны. У моллюсков около 75-80 % цитозольного кадмия связывается с МТ и только 20-25 % его остается не связанным с тиольными группами [4]. Высокий уровень индуцированных МТ в клетках гепатопанкреаса является достаточным для обеспечения защиты клеток и предотвращает связывание кадмия с клеточными белками. С другой стороны, в изолированных клетках жабер отсутствует достоверная индукция металлотионеинов, что может привести к избытку кадмия, не связанного с тиольными группами, стрессу и экспрессии БТШ, необходимой для репарации поврежденных белков и/ или их деградации [4]. Данные о влиянии кадмия на ткани виргинских устриц показывают увеличение концентрации индуцибельных МТ в жабрах при содержании с кадмия хлоридом. Отсутствие увеличения экспрессии МТ в клетках жабер при короткой инкубации (4 ч) с этим металлом свидетельствует о более низкой скорости транскрипции в клетках жабер в присутствии кадмия, возможно, это связано с замедленной биосинтетической активностью жабер.

1. Влияние кадмия на ткани виргинских устриц (n=12)

2. Влияние кадмия на изолированные клетки виргинских устриц (n=10)

Примечания : * и ** - достоверности различия с контролем Р <0,05 и

<0,01.

В качестве системы защиты второго ряда была измерена экспрессия белков теплового шока (БТШ) в тканях и в изолированных клетках. При действии кадмия in vivo происходило увеличение экспрессии БТШ 69 в обеих тканях и БТШ 90 в гепатопанкреасе (таблица 1). При действии же кадмия in vitro происходило увеличение количества БТШ 69 и БТШ 60 в клетках жабер, и отсутствовали изменения в экспрессии белков теплового шока в гепатопанкреасе. БТШ 60 – белок, конститутивно экспрессирующийся в митохондриях, являющихся мишенью для действия кадмия [3], таким образом, логично увеличение экспрессии БТШ 60 при инкубации клеток с кадмия хлоридом.

В отличие от БТШ 60, БТШ 70 и БТШ 90 являются цитоплазматическими белками и ассоциированы с фолдингом белков . Показано увеличение экспрессии БТШ 72 и БТШ 90 в кератиноцитах и фибробластах , в первичной культуре гепатоцитов крысы , а также БТШ 32, 72, 90 и 110 в клетках меланомы человека в ответ на кадмий [5]. В жабрах и гепатопанкреасе устриц Ostrea edulis кадмий увеличивал синтеза БТШ 70 [6]. Нами не обнаружено увеличение экспрессии БТШ 90 в ответ на кадмий . Известно , что бивалентные металлы могут ингибировать шаперонную активность БТШ 90, тем самым , делая его менее эффективным в защите цитоплазамических белков [7]. Возможно , увеличение экспрессии БТШ 70 при действии кадмия хлорида обеспечивает достаточную защиту цитоплазматических белков в изолированных клетках , что делает необязательным увеличение экспрессии БТШ 90.

Заключение . Выявлены особенности эффекта кадмия на протеосинтетический ответ жабер и гепатопанкреаса на клеточном и тканевом уровнях . В обоих органах кадмий вызывал увеличение экспрессии металлотионеинов ( в жабрах с 0,49 до 16,4, в гепатопанкреасе - с 3,66 до 20,64) и белков теплового шока ( БТШ 69 - в 9 раз в обеих тканях ). В изолированных же клетках происходило увеличение либо экспрессии МТ ( гепатопанкреас - в 2,5-7,8 раза ), либо БТШ ( жабры – в 1,24-1,73 раза ).

ЛИТЕРАТУРА: 1. Ivanina A.V. Effects of elevated temperature and cadmium exposure on stress protein response in eastern oysters Crassostrea virginica (Gmelin) / A.V. Ivanina, C. Taylor, I.M. Sokolova // Aquatic Toxicology. -2009. - vol. 91. - № 3. - p. 245-254. 2. Ivanina A.V. Effects of cadmium on cellular protein and glutathione synthesis and expression of stress proteins in eastern oysters, Crassostrea virginica Gmelin / A.V. Ivanina, A.S. Cherkasov, I.M. Sokolova // Aquatic Toxicology. - 2008. - vol. 211. - p. 577586. 3. Cherkasov, A.S. Temperature-dependent effects of cadmium and purine nucleotides on mitochondrial aconitase from marine ectotherm, Crassostrea virginica: a role of temperature in oxidative stress and allosteric enzyme regulation / A.S.Cherkasov, R.A. Overton, Jr, E.P. Sokolov, I.M. Sokolova // J. Exp. Biol. -2007.- vol. 210.- p. 46-55. 4. Пыхтеева Е.Г. In vitro моделирование действия кадмия на эпителиальные клетки при предварительной индукции металлотионеина in vivo / Е.Г. Пыхтеева, Е.А. Потапов, Д.В. Большой, Е.Д. Пыхтеева // Актуал. пробл. транспортной медицины. – 2011. – т. 24. - № 2. 5. Urani,C. Cytotoxity and induction of protective mechanisms in HepG2 cells exposed to cadmium / C. Urani, P. Melchoretto, C. Canevali, G.F. Crosta // Toxicol. In Vitro. - 2005. - vol. 19. - p. 887-892. 6. Челомин В.П. Биохимические механизмы адаптации мидии Mytilus trossulus к ионам кадмия и меди / В.П. Челомин, Н.Н. Бельчева, М.В. Захарцев // Биол. моря. - 1998. – 24. - № 5. - С. 319 - 325. 7. Jakob, U. Structural organisation of procariotic and eucariotic Hsp 90. Influence of divalent cations on structure and function / U. Jakob, I. Meyer, H. Bugl, S. Andre, J.C. Bardwell, J. Buchner // J. Biol. Chem. - 1995. - vol. 270. - p. 1441214419.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ КАДМИЯ IN VIVO И IN VITRO НА ЖИВОТНУЮ КЛЕТКУ

Иванина А . В .

Резюме

В данной статье приведено сравнение действия кадмия хлорида in vivo и in vitro на виргинских устриц Crassostrea virginica . Показаны особенности протеосинтетического ответа жабер и гепатопанкреаса на клеточном и тканевом уровнях .

BIOLOGICAL EFFECT OF IN VIVO AND IN VITRO CADMIUM EXPOSURE ON CELL

Ivanina A.V.