Биологические особенности и условия поверхностного культивирования штамма-продуцента микробиопрепарата 11-3 Bacillus sp. - антагониста возбудителей фузариоза льна масличного

Введение. В последние годы, в связи с возрастанием роли технологий органического земледелия, разработка биотехнологий получения и применения современных конкурентоспособных микробиологических препаратов становится первоочередной задачей как в мире, так и в нашей стране.

В лаборатории биометода Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур имени В.С.

Пустовойта (ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК) в течение многих лет ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных культур от болезней [1]. В последние годы проводится работа по поиску перспективных штаммов-продуцентов для создания микробиопрепаратов против возбудителя фу-зариоза льна масличного [2; 3; 4; 5]. Одним из перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепарата против возбудителей фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wr.) Bilai и Fusarium poae (Peck) Wollenw., Lewis является бактериальный штамм 113 Bacillus sp.

Для разработки технологического регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме «смачивающийся порошок» (СП) изучали культуральные и физиологические признаки штамма-продуцента 11-3 Bacillus sp., осуществляли подбор оптимальных сложных жидких питательных сред и условий поверхностного культивирования антагониста.

Материалы и методы. Культуральные признаки перспективного штамма антагониста 11-3 Bacillus sp . изучали по общепринятым методикам на трёх агаризированных питательных средах – картофельно-саха-розном агаре (КСА), Чапека для бактерий и Тайлона [6; 7; 8]. Определяли особенности роста, форму, размер, поверхность, профиль, цвет, блеск и прозрачность колоний, а также их край, структуру и консистенцию на десятые сутки инкубации [9; 10].

Физиологические признаки активного штамма изучали на жидкой питательной среде Чапека для бактерий. Поверхностное культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера (250 мл) с объемом питательной среды 100 мл, высевая одинаковый агаровый блок со штаммом-антагонистом, заменяя источники углеродного и азотного питания. Источниками углеродного питания служили глюкоза, сахароза, глицерин и меласса, азотного питания – пептон, азотнокислый натрий, дрожжевой и кукурузный экстракты.

Для определения оптимальной температуры культивирования штамм выращивали на жидкой питательной среде Тайлона при температурах 20, 25, 30, и 35 °С.

Для определения оптимальной кислотности среды штамм выращивали на жидкой питательной среде Тайлона при оптимальной температуре. Добавлением лимонной кислоты или щелочи (4 н. раствор NaOH) pН среды устанавливали в пределах 3; 6; 8 и 10.

Подбор оптимальных жидких питательных сред для выращивания перспективного штамма проводили на жидких средах в условиях поверхностного культивирования. Испытывали ряд питательных сред: мясо-пептонный бульон (МПБ) [11], Тайлона, Чапека для бактерий, пеп-тон-дрожжевую [12].

Рост бактерии на жидкой среде оценивали по разработанной нами шкале.

По окончании культивирования определяли сухой остаток бактериальной массы после высушивания при температуре 105 оС до постоянного веса.

Для установления оптимальных сроков поверхностного культивирования штамм-продуцент выращивали на жидкой питательной среде Тайлона в трехлитровых стеклянных баллонах в течение 10, 15 и 20 суток. Определяли массу порошка и титр. Для определения оптимального объёма посевной культуры к 500 мл питательной среды добавляли 2 и 4 % глубинной культуры антагониста, предварительно выращенной на жидкой среде, на качалке (195 об./мин) в течение 2-х суток. Титр СП определяли микробиологическим способом [13]. Повторность в каждом опыте 3-кратная.

Результаты и обсуждение. Для разработки технологического регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме (СП) изучены культуральные и физиологические признаки штамма-продуцента 11-3 Bacillus sp., проведен подбор оптимальных сложных жидких питательных сред и условий поверхностного культивирования антагониста.

Культуральные признаки колоний штамма 11-3 Bacillus sp .

Культуральные признаки штамма 11-3 Bacillus sp . изучены на агаризированных средах КСА, Чапека для бактерий и Тайлона (табл. 1, рис. 1). На среде КСА форма колоний неправильная, поверхность гладкая, профиль колоний срастающийся с агаром, колонии непрозрачные, структура колоний мелкозернистая, консистенция слизистая. Диаметр колоний на десятые сутки инкубации – 23,0–23,3 мм.

Таблица 1

Культуральные признаки колоний штамма 11-3 Bacillus sp. при температуре 30 оС г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Характеристика признаков	Питательная среда
	КСА	Чапека для бактерий	Тайлона
1. Форма колоний	Неправильная	Круглая	Неправильная
2. Диаметр колоний, мм	23,0–23,3	12,0–11,3	76,7–78,3
3. Край колоний	Волнистый	Гладкий	Зубчатый
4. Поверхность колоний	Гладкая	Гладкая	Гладкая
5. Профиль колоний	Срастающийся с агаром	Срастающийся с агаром	Плоский
6. Оптические свойства поверхности колоний	Непрозрачные	Непрозрачные	Непрозрачные
7. Структура колонии	Мелкозернистая	Однородная	Мелкозернистая
8. Консистенция	Слизистая	Сухая	Слизистая

На среде Чапека для бактерий форма колоний круглая, поверхность гладкая, профиль срастающийся с агаром, колонии непрозрачные, структура колоний однородная, консистенция сухая. Диаметр колоний на десятые сутки инкубации – 11,3–12,0 мм.

На среде Тайлона форма колоний неправильная, поверхность гладкая, профиль плоский, колонии непрозрачные, структура колоний мелкозернистая, консистенция слизистая. Диаметр колоний на десятые сутки инкубации – 76,7–78,3 мм .

КСА

Чапека для бактерий среда Тайлона

Рисунок 1 – Рост штамма 11-3 Bacillus sp. на агаризированных средах при температуре 30 ^оС (ориг.)

Физиологические признаки штамма 11-3 Bacillus sp.

Рост бактерии на жидкой среде оценивали по разработанной нами шкале, балл (рис. 2):

0 – нет роста или только обрастание посевного блока;

• 1    – рост бактерии отдельными колониями;

• 2    – бактериальная плёнка поверхностная, сплошная;

• 3    – бактериальная плёнка сплошная, с массовым глубинным ростом.

0 баллов             1 балл

2 балла             3 балла

Рисунок 2 – Рост штамма 11-3 Bacillus sp . на жидких питательных средах в соответствии с разработанной шкалой по баллам (ориг.)

Определена оптимальная температура и реакция среды для культивирования штамма 11-3 Bacillus sp.

Штамм 11-3 Bacillus sp . выращивали на жидкой питательной среде Тайлона при 20, 25, 30 и 35 °С (табл. 2).

Таблица 2

Влияние температуры на рост штамма 11-3 Bacillus sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Тайлона г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Штамм	Температура, оС
	20        1	25        1	30        1	35
	Рост бактерии, балл / Вес сухой бактериальной массы, г *
11-3 Bacillus sp.	1/0,07 ± 0,01	2/0,11 ± 0,03	3/0,25 ± 0,05	3/0,23 ± 0,05

* Вес сухой бактериальной массы в расчете на 100 мл питательной среды

Обильный рост колоний штамма 11-3 Bacillus sp. и максимальный вес сухой бактериальной массы отмечен в диапазоне температур 30–35 °С.

Установлена оптимальная кислотность среды, которую определяли, выращивая штамм 11-3 Bacillus sp. на жидкой питательной среде Тайлона с разными значениями рН при оптимальной температуре 30 ^оС (табл. 3).

Таблица 3

Влияние рН среды на рост штамма 11-3 Bacillus sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Тайлона при температуре 30 оС г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Штамм	рН среды
	3,0	6,0	8,0	10,0
	Рост бактерии, балл / Вес сухой бактериальной массы, г *
11-3 Bacillus sp.	1/0,03 ± 0,01	2/0,13 ± 0	3/0,23 ± 0,08	3/0,23 ± 0,10

* Вес сухой бактериальной массы в расчете на 100 мл питательной среды

Установлен активный рост бактерии в диапазоне рН среды от 8 до 10, при этом отмечен одинаковый максимальный вес сухой бактериальной массы (0,23 г на 100 мл питательной среды).

Оптимальные источники питания для культивирования штамма 11-3 Bacillus sp .

Установлены оптимальные источники питания, которые определяли, выращивая штамм 11-3 Bacillus sp . на жидкой питательной среде Чапека для бактерий при температуре 30 ^оС. Источниками углеродного питания служили глюкоза, сахароза, меласса и глицерин (табл. 4).

Таблица 4

Влияние источников углерода на рост штамма 11-3 Bacillus sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Чапека для бактерий при температуре 30 оС г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Штамм	Источник углерода
	глицерин	глюкоза	сахароза	меласса
	Рост бактерии, балл / Вес сухой бактериальной массы, г *
11-3 Bacillus sp.	3/0,23 ± 0,04	1/0,03 ± 0	2/0,12 ± 0,02	3/0,27 ± 0,07

* Вес сухой бактериальной массы в расчете на 100 мл питательной среды

Максимальный рост и вес сухого остатка бактериальной массы отмечены при использовании в качестве единственного источника углерода мелассы и глицерина (0,23–0,27 г на 100 мл питательной среды).

Источниками азота служили азотнокислый натрий, пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты. Максимальный рост и вес сухой бактериальной массы отмечены при использовании в качестве единственного источника азота дрожжевого и кукурузного экстракта (0,58–0,60 г на 100 мл питательной среды) (табл. 5).

Таблица 5

Влияние источников азота на рост штамма 11-3 Bacillus sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Чапека для бактерий при температуре 30 оС г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Штамм	Источник азота
	пептон	дрожжевой экстракт	кукурузный экстракт	азотнокислый натрий
	Рост бактерии, балл / Вес сухой бактериальной массы, г *
11-3 Bacillus sp .	2/0,36 ± 0,03	3/0,58 ± 0,09	3/0,60 ± 0,02	1/0,12 ± 0

* Вес сухой бактериальной массы в расчете на 100 мл питательной среды

Таким образом, для штамма-продуцента микробиопрепарата 11-3 Bacillus sp .

установлены оптимальные условия культивирования: температура – 30–35 оС, рН среды – 8–10. В качестве источников углеродного питания можно использовать глицерин и мелассу. Оптимальными источниками азотного питания установлены дрожжевой и кукурузный экстракты.

Оптимальные сложные жидкие питательные среды для штамма 11-3 Bacillus sp.

Испытывали сложные жидкие питательные среды Тайлона, Чапека для бактерий, мясо-пептонный бульон (МПБ) и пептон-дрожжевую среду, содержащие углеводы и в разном соотношении соединения азота, фосфора, калия и магния, а также микроэлементы (табл. 6).

Таблица 6

Влияние сложных жидких питательных сред на рост штамма-продуцента микробиопрепарата 11-3 Bacillus sp.

при температуре 30 оС г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Штамм	Питательная среда
	Тайлона	Чапека для бактерий	МПБ	Пептон-дрожжевая среда
	Рост бактерии, балл / Вес сухой бактериальной массы, г *
11-3 Bacillus sp .	3/0,65 ± 0,07	1/0,04 ± 0	2/0,28 ± 0,06	2/0,22 ± 0,06

* Вес сухой бактериальной массы в расчете на 100 мл питательной среды

Оптимальной сложной жидкой питательной средой для культивирования перспективного бактериального штамма 11-3 Bacillus sp. установлена среда Тайлона, на которой вес сухой бактериальной массы составил 0,65 г на 100 мл питательной среды против 0,04–0,28 г на других средах.

Оптимальный срок поверхностного культивирования и объём посевной культуры для бактерии-антагониста на жидкой питательной среде

Определен оптимальный срок поверхностного культивирования и объём посевной суспензии бактериального штамма-продуцента микробиопрепарата 11-3 Bacillus sp. на жидкой питательной среде Тайлона (табл. 7).

Таблица 7

Влияние срока поверхностного культивирования и объёма посевной суспензии бактериального штамма-продуцента 11-3 Bacillus sp. на массу и титр лабораторных образцов микробиопрепарата г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Вариант	Объём посевной сус-пен-зии, %	Срок культивирования, сутки
		10		15		20
		Масса СП*, г	Титр, КОЕ/г	Масса СП, г	Титр, КОЕ/г	Масса СП, г	Титр, КОЕ/г
11-3 Bacillus sp .	2,0	10,81 ± 0,08	1,3 × 1012	7,27 ± 0,03	1,1 × 1012	8,69 ± 0,03	4,7 × 1012
	4,0	11,18 ± 0,03	2,1 × 1012	7,45 ± 0,07	3,3 × 1012	9,38 ± 0,05	4,1 ×1012

* СП – микробиопрепарат в препаративной форме «смачивающийся порошок»

Установлено, что при всех сроках поверхностного культивирования 11-3 Bacillus sp . на жидкой питательной среде Тайлона получен СП с влажностью 6,8 %. Так, при объёме посевной суспензии 2,0 % с 500 мл питательной среды получено 7,27–10,81 г СП против 7,45–11,18 г при добавлении 4,0 % посевной суспензии. Титр СП не зависел от сроков культивирования и объёма посевной суспензии штамма-продуцента и был одного порядка во всех вариантах (1,1– 4,7 × 10¹² КОЕ/г).

Таким образом, оптимальный срок поверхностного культивирования бактериального штамма 11-3 Bacillus sp . на жидкой питательной среде Тайлона составил десять суток, а оптимальный объём посевной культуры к питательной среде – 2,0 %.

Выводы. 1. Обильный рост колоний штамма 11-3 Bacillus sp. и максимальный вес сухой бактериальной массы отмечены в диапазоне температуры 30–35 °С и рН среды от 8 до 10.

• 2.    Из источников углерода максимальный рост и выход сухого остатка бактериальной массы штамма 11-3 Bacillus sp . обеспечило введение в питательную среду мелассы.

• 3.    Максимальный рост и вес сухой бактериальной массы штамма 11-3 Bacillus sp . отмечены при использовании в качестве

• 4.    Оптимальной сложной питательной средой для культивирования перспективного бактериального штамма 11-3 Bacillus sp . установлена среда Тайлона.

• 5.    Оптимальный срок поверхностного культивирования бактериального штамма 11-3 Bacillus sp . на жидкой питательной среде Тайлона составил десять суток, а оптимальный объём посевной культуры к питательной среде – 2,0 %.

единственных источников азота дрожжевого и кукурузного экстрактов.