Биологические особенности штамма-продуцента микробиопрепарата Т-2 Trichoderma sp. - антагониста возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника

Введение. Подсолнечник – ведущая масличная культура в России и многих других странах мира. Серьезным препятствием для получения высоких урожаев подсолнечника зачастую становятся различные болезни. Ложная мучнистая роса (ЛМР), вызываемая облигатным паразитом – оомицетом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni, относится к числу наиболее вредоносных. Основным способом борьбы с этой болезнью является селекционный. Создаваемые в нашей стране сорта и гибриды подсолнечника были устойчивыми к наиболее распространённым расам патогена. Однако с началом 90-х годов XX столетия, когда в

Россию начали завозить семенную продукцию подсолнечника иностранных фирм (Франции, Испании, США и других), увеличилась вероятность ввоза новых рас патогена с семенами из-за рубежа. С интенсификацией возделывания подсолнечника и увеличением разнообразия сортимента ускорился естественный процесс сопряжённой эволюции паразита и хозяина, способствующий формированию новых рас. В связи с этим ранее устойчивые сорта и гибриды поражаются болезнью в сильной степени, что приводит к существенному снижению урожая и его качества.

Существующий химический способ защиты подсолнечника от ЛМР с помощью фунгицида Апрона (металаксил, ме-феноксам) снизил свою эффективность в связи с возникающей резистентностью возбудителя болезни [1].

Решение проблемы защиты от болезней связано с разработкой комплекса мероприятий, включающих и микробиологический метод. Снижение отрицательного влияния химических средств защиты растений на окружающую среду и человека остаётся одной из наиболее актуальных проблем современности. Разработка микробиологических средств защиты от фитопатогенов является важной, неотъемлемой компонентой интегрированной защиты растений в современном растениеводстве, а в ряде случаев – единственным средством контроля.

В России нет микробиологических препаратов, зарегистрированных для защиты сельскохозяйственных культур от возбудителей ложной мучнистой росы. Однако исследования в области поиска биологических средств защиты растений от возбудителя этой болезни проводятся и в нашей стране и за рубежом [1–7].

В лаборатории биометода Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур имени В.С. Пус-товойта (ФГБНУ ВНИИМК) в течение многих лет ведутся исследования по раз-82

работке микробиологических средств защиты масличных культур от болезней. Создана уникальная коллекция штаммов грибов и бактерий – антагонистов возбудителей белой, серой гнилей, фузариоза и фомопсиса, продуцентов микробиопрепаратов для защиты от болезней масличных и других сельскохозяйственных культур [8]. В последние годы проводится работа по поиску перспективных штаммов для создания микробиопрепаратов против возбудителя ложной мучнистой росы [9]. В результате скрининга грибов и бактерий из коллекции лаборатории выделено 14 перспективных штаммов антагонистов возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника. Одним из перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепарата против ЛМР является гриб T-2 Trichoderma sp. Наряду с фунгицидной активностью против ЛМР установлено отсутствие угнетающего влияния штамма на культуру подсолнечника и выявлено его ростостимулирующее действие, которое проявляется в увеличение массы корня проростков за счет интенсивного развития боковых корней [10].

Для разработки технологического регламента производства микробиопрепарата изучали морфолого-культуральные и физиологические признаки штамма-продуцента T-2 Trichoderma sp., осуществляли подбор оптимальных сложных жидких питательных сред при поверхностном культивировании.

Материалы и методы. Морфологокультуральные признаки и физиологические свойства перспективного штамма антагониста T-2 Trichoderma sp. изучали по общепринятым методикам [11; 12; 13].

Морфологические признаки активного штамма определяли с помощью микроскопа «Motic BA 300». Изучали строение, цвет и размер мицелия, конидиеносцев и конидий [14].

Культуральные признаки изучали на трёх твёрдых питательных средах: карто-фельно-сахарозном агаре (КСА), Чапека и Рудакова [15]. На каждую питательную среду одновременно в центр чашки Петри (ЧП) высевали штамм антагониста и помещали в термостат при температуре 25,0 оС. Описывали форму колоний, их структуру, цвет с лицевой и обратной стороны, край, начало и характер спороношения.

Физиологические признаки штамма изучали на жидкой питательной среде Чапека, заменяя источники углеродного и азотного питания, в тех же дозировках. Источниками углеродного питания служили крахмал, глюкоза, маннит, сахароза; азотного питания – тиомочевина, мочевина, хлористый аммоний, азотнокислый аммоний, кукурузный экстракт.

Для определения оптимальной температуры культивирования штамм выращивали на среде Чапека при температурах 20,0; 25,0; 30,0 и 35,0 оС.

Для определения оптимальной кислотности среды штаммы выращивали на жидкой среде Чапека при оптимальной температуре. Добавлением лимонной кислоты или щёлочи pH среды устанавливали в пределах 3,0; 6,0; 8,0 и 10,0.

Оптимальные элементы питания штамма гриба-антагониста, питательные среды, температуру и рН среды определяли следующим образом: гриб культивировали поверхностным способом в течение десяти суток в колбах Эрленмейера объемом 250,0 мл, со 100 мл жидкой питательной среды, при температуре 25,0 оС. Рост мицелиальной пленки (газона) оценивали по шкале:

0 – нет роста;

• 1    – рост мицелия отдельными колониями;

• 2    – мицелиальная плёнка сплошная тонкая;

• 3    – мицелиальная плёнка сплошная толстая.

По окончании культивирования определяли сухую массу мицелиальной пленки – высушиванием влажного мицелия при температуре 105,0 оС до постоянного веса. Повторность в каждом опыте трехкратная.

Подбор оптимальных питательных сред для выращивания перспективного штамма-антагониста проводили на жидких средах при стационарном культивировании. Испытывали ряд сложных питательных сред: Чапека, Рудакова, Ви-керхема и среда № 1, в состав которых входят минеральные соли, сахара, микроэлементы и кукурузный экстракт.

Результаты и обсуждение . Морфолого-культуральные признаки штамма Т-2 Trichoderma sp.

Морфологические признаки. Мицелий состоит из бесцветных, сильно ветвистых гиф 1–12 мк в диаметре. Хламидоспоры интеркаллярные, реже верхушечные, на коротких боковых веточках, шаровидные, бесцветные, гладкие, до 14 мк в диаметре, образуются в среде. Конидиеносцы сильно ветвистые в подушечках, в прерывистых или концентрических зонах, с главной осью около 4,5 мк толщины, с боковыми веточками, одиночными или в группах по 2–3. Все веточки отходят под широким углом. Стеригмы образуют ложные мутовки, изменчивые по величине – 8–14 × 2,4–3 мк, прямые или слегка согнутые, кеглевидные, суженные у основания. Конидии шаровидные, слегка шероховатые, 3,6–4,5 мк в диаметре

Культуральные признаки. Культуральные признаки штамма гриба-антагониста изучали через десять суток инкубации при температуре 25 ^оС (рис. 1, табл. 1).

Колонии быстрорастущие, занимали всю поверхность питательной среды за 3– 4 суток.

Таблица 1

Культуральные признаки штамма Т-2 Trichoderma sp. при культивировании на агаризированных средах (возраст 10 суток) при температуре 25 оС.

г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.

среда Чапека

среда КСА

среда Рудакова

Рисунок 1 – Рост штамма Т-2 Trichoderma sp. на агаризированных питательных средах (возраст 10 суток) при температуре 25 ^оС

Вариант	Характеристика колонии				Диаметр колонии, см, через, суток		Спо-роно-ше-ние
Среда	рост колонии	цвет, со стороны		рост ми- це-лия, балл	3	10
		лицевой	обратной
Чапека	Слабый, колонии занимают всю поверхность ЧП, подушечки по краям редкие, в центре расположены кон-центрическими зонами	Зелёный	Свет-ло-зе-лёный	5	5,0 × 5,5	9,0 × 9,0	Массовое
КСА	Средний, колонии занимают всю поверхность ЧП, подушечки расположены плотными концентрически-ми зонами, но между зонами мицелий редкий	Голубова-то-зелёный с не-большим беловатым налётом	Свет-ло-зе-лёный	5	8,8 × 9,0	9,0 × 9,0	Массовое
Рудакова	Сильный, колонии занимают всю поверхность ЧП, подушечки расположены плотными концентрически-ми зонами	Голубова-то-зелёный, с беловатым налётом сверху	Корич-нево-зе-лёный	5	9,0 × 9,0	9,0 × 9,0	Массовое

На среде Чапека рост слабый, колонии занимали всю поверхность ЧП, но подушечки редкие, расположены концентрическими зонами, зелёного цвета, мицелий между зонами прозрачный. С обратной

стороны среда окрашена в светло-зелёный цвет.

На КСА рост средний, колонии занимали всю поверхность ЧП, подушечки расположены плотными концентрическими зонами, но между зонами мицелий редкий, голубовато-зелёного цвета с небольшим беловатым налётом. С обратной стороны окраска среды светло-зелёная.

На среде Рудакова рост сильный, колонии занимали всю поверхность ЧП, подушечки расположены плотными концентрическими зонами, голубовато-зеленые в центре, со светлым налётом сверху. С обратной стороны среда окрашена в коричнево-зелёный цвет.

Таким образом, наиболее сильный рост колоний штамма Т-2 Trichoderma sp. с обильным спороношением через 10 суток культивирования при температуре 25 ^оС отмечен на агаризированной питательной среде Рудакова.

Физиологические признаки штамма Т-2 Trichoderma sp.

Определение оптимальной температуры и реакции среды для культивирования штамма Т-2 Trichoderma sp .

Гриб – аэроб. Установлено, что наиболее благоприятным для роста мицелия и спороношения является выращивание гриба при температурах 25–30 оС (табл. 2).

Таблица 2

Влияние температуры на рост штамма Т-2 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Чапека г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.

Температура, оС	Рост мицелия	Вес сухого мицелия, г*
20	Средний	0,06 ± 0,01
25	Обильный	0,11 ± 0,05
30	Сильный	0,09 ± 0,01
35	Средний	0,05 ± 0,01

* – вес мицелия в расчете на 100 мл питательной среды

Гриб Т-2 Trichoderma sp. оказался требовательным к реакции среды. Максимальный рост мицелия со спороношением и наибольшую сухую массу обеспечило стационарное выращивание гриба на жидкой среде Чапека в диапазоне рН среды от 3 до 6 (табл. 3).

Таблица 3

Влияние рН среды на рост штамма Т-2 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Чапека при температуре 25 оС г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.

рН среды	Рост мицелия	Вес сухого мицелия, г*
3	Обильный	0,12 ± 0,01
6	Средний	0,06 ± 0,007
8	Слабый	0,01 ± 0
10	Слабый	0,01 ± 0

* – вес мицелия в расчете на 100 мл питательной среды

Определение оптимальных элементов питания для культивирования штамма Т-2 Trichoderma sp .

При стационарном выращивании гриба на жидкой среде Чапека при температуре 25 оС с добавлением разных источников углерода максимальный рост мицелия и увеличение его сухой массы обеспечило введение в питательную среду крахмала (табл. 4).

Таблица 4

В серии лабораторных опытов выявлено, что из источников азота кукурузный 85

Влияние источников углерода на рост штамма Т-2 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Чапека при температуре 25 оС г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.

Источник углерода	Рост мицелия	Вес сухого мицелия, г*
Крахмал	Обильный	0,24 ± 0,08
Глюкоза	Средний	0,15 ± 0,03
Маннит	Слабый	0,05 ± 0
Сахароза	Средний	0,11 ± 0,05

* – вес мицелия в расчете на 100 мл питательной среды экстракт способствовал обильному росту мицелия гриба и максимальной сухой массе по сравнению с другими вариантами (табл. 5).

Таблица 5

Влияние источников азота на рост штамма Т-2 Trichoderma sp. в условиях стационарного культивирования на жидкой среде Чапека при температуре 25 оС г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.

Источник азота	Рост мицелия	Вес сухого мицелия, г*
Мочевина	Средний	0,13 ± 0,01
Тиомочевина	Слабый	0,01 ± 0
NH 4 NO 3	Средний	0,07 ± 0,01
NH 4 Cl	Средний	0,09 ± 0,01
Кукурузный экстракт	Обильный	0,29 ± 0,07

* – вес мицелия в расчете на 100 мл питательной среды

Определение оптимальных жидких питательных сред для штамма Т-2 Trichoderma sp.

Подбор оптимальных питательных сред для штамма Т-2 проводили при стационарном культивировании на жидких питательных средах сложного состава – Рудакова, Чапека, Викерхема и среде № 1, содержащих углероды и соединения азота, фосфора, калия и магния, а также микроэлементы в разном соотношении (табл. 6).

Таблица 6

Влияние жидких питательных сред и срока стационарного культивирования на рост штамма Т-2 Trichoderma sp. при температуре 25 оС г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.

Питательная среда	Рост мицелия, балл*, через, суток			Вес сухого мицелия, г** через 10 суток
	3	5	10
Чапека	0	0	1	0,09 ± 0
Рудакова	1	2	3	0,93 ± 0,03
Викерхема	1	2	2	0,43 ± 0,07
Среда №1	2	2	3	0,67 ± 0,03