Биологический консервант на основе штамма Lactococcus lactis subsp. Lactis F-116

Главная особенность лактобактерий заключается в способности предотвращать рост патогенных микроорганизмов за счет синтеза антимикробных метаболитов, таких как молочная кислота, перекиси, диацетил и др., но все же, ведущее место в объяснении явления антагонизма лактококков отводится специфическим антибиотическим веществам белковой природы – бактериоцинам. Наиболее изученным является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков с 1998 г. имеющий, как и его продуцент Lactococcus lactis ssp. lactis, cтатус «GRAS» (Generally Recognized As Safe). Низин разрешен для использования в пищевой промышленности как добавка (код Е234). Описаны несколько форм низинов (A, B, C, D, E, Z, R, Q) и родственных им лактицинов, продуцентами которых являются разные штаммы Lactococcus lactis ssp. lactis [1].

Однако L. lactis subsp. lactis , как и их бактериоцины, действуют только на грамполо-жительные бактерии. К тому же длительное использование низина привело к развитию устойчивых к нему патогенов, препарат теряет активность при нейтральных и щелочных значениях рН, может инактивироваться протеолитическими ферментами, а ненасыщенные аминокислоты, входящие в его состав, легко взаимодействуют с аминокислотами, фосфатными группами ферментов, присутствующими в сырье, что приводит к снижению или потере активности препарата [2, 3, 4]. Кроме того, использование низина в качестве консерванта не решает проблему порчи пищевых продуктов и сырья при хранении, основной причиной микробиальной порчи которых являются патогены, относящиеся к грамотрицательным бактериям и микроскопическим грибам. Поиск и конструирование штаммов лактококков, обладающих широким спектром антибактериального и фунгицидного действия, - это актуальная проблема научных исследований последних лет. На кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова методом клеточной инженерии были получены новые гибридные штаммы L. lacti s subsp. lactis с низинсинтезирующей активностью, в 12-14 раз превышающей активность родительских штаммов и обладащие широким спектром антимикробного действия [4, 5, 6].

Цель исследования

Получение эффективного пищевого консерванта на основе нового гибридного штамма Lactococcus lactis ssp . lactis F-116.

Материалы и методы

Объектом исследования служил гибридный штамм L. lactis ssp. lactis F-116 (GenBank EF100777), полученный методом слияния протопластов родственных штаммов , низкопродуктивный по синтезу низина [4].

При изучении спектра антимикробного действия в качестве тест-культур использовали 5 штаммов грамположительных бактерий: Micrococcus luteus 128 , M. flavus, Bacillus mycoides 32, B. subtilis 2 , B. coagulans 429, Staphylococcus aureus 144; 5 штаммов грамотрицательных бактерий : Alcaligenes faecalis 82, Escherichia coli 52, Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, Proteus vulgaris 206; а также два штамма дрожжей: Candida guilliermondii 217, Rhodotorula aurantiaca 226, и три штамма грибов: Aspergillus niger 369, Penicillium chrysogenum 32 , Fusarium oxysporum 9. Штаммы были получены из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ.

Методом лиофильной сушки культуральной жидкости штамма F-116 получен препарат бактериоцина ЛГС. Параметры сушки: температура замораживания - 40^оС, сублимации - 30^оС, максимальная температура досушки продукта - 60 ^оС.

Токсикологические исследования штамма F-116 и препарата ЛГС проводили на лабораторных животных (белых мышах и морских свинках) и культуре простейших - инфузории Tetrahimena pyriformis в соответствии с методическими указаниями [7].

Проведены исследования по применению нового бактериоцина ЛГС и культуральной жидкости продуцента этого бактериоцина L.lactis subsp . lactis F-116 в качестве пищевых консервантов. В качестве пищевого сырья служили образцы охлажденного мяса (говядины) и рыбы (осетрины). Сравнивали их действие с коммерческим препаратом низина «Nisaplin», лизоцимом в концентрации 0,25%, препаратом ППС-10 (полимерным пленкообразующим составом на основе триглицеридов), сочетали обработку с аскорбиновой и молочной кислотами. Основой покрытия образцов служил 5%-ный раствор сухой молочной сыворотки с добавлением 2% желатины. Изучали общую бактериальную обсемененность образцов, обработанных вышеуказанными биологическими и химическими консервантами с последующей упаковкой в пленку под вакуумом и заложенных на хранение при 4°С на 85 суток. Отбор проб проводили через 7, 10, 15, 20 и 35 дней.

В образцах мяса определяли наличие ряда бактерий, способных расти и развиваться в условиях повышенной влажности: Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris , Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Enterococcus, споровые аэробные и анаэробные формы , включая, бактерии из рода Clostridium, Bacillus cereus , а также дрожжи, плесени [8].

Результаты и обсуждение

Эксперимент по изучению динамики роста и развития штамма F-116 на биосинтетической среде с глюкозой показал, что увеличение бактериоцинобразующей активности происходило параллельно росту культур: за 9 ч инкубирования уровень биомассы достиг максимального значения (ОП 540 1,37), а активность увеличилась до 4200 МЕ/мл. Антимикробная активность препарата ЛГС, полученного высушиванием культуральной жидкости штамма F-

• 116,    после 12 ч инкубирования составила 1200 тыс. МЕ/г (в пересчете на активность по стандартному препарату «Nisaplin»).

Бактериоцин ЛГС по биологическому действию превосходил коммерческий препарат по спектру действия: был эффективен против бактерий группы кишечной палочки (БГКП) Escherichia coli, Salmonella gallinarum, Proteus vulgaris, Serratia marsescens, и других грамот-рицательных микроорганизмов, включая P. aeruginosa, а также грамположительных: Staphylococcus aureus, M. flavus, B. subtilis, B. mycoides, В. coagulans, Listeria monocytogenes , ингибировал рост мицелиальных грибов A. niger, Fusarium oxysporum и дрожжей - Saccharomyces cerevisiae, Сandida gualirmondii, Rhodotorula aurantica (табл. 1) .

Таблица 1

Ингибиторное действие препарата ЛГС на разные микроорганизмы в сравнении с низаплином

Микроорганизмы	Концентрация, мг/мл
	препарат ЛГС				низаплин
	5 1	10 1	20 1	40	5 1	10 1	20 1	40
	Диаметр зон ингибирования, мм
Bacillus coagulans	10,0	14,0	16,4	19,0	0	10,0	13,0	16,0
Micrococcus flavus	11,0	14,3	20,0	20,0	0	9,0	12,0	14,0
Staphylococcus aureus	10,0	14,0	15,0	20,5	0	10,5	12,0	15,0
Listeria monocytogenes	12,0	16,0	20,0	19,5	0	10,0	12,0	14,0
Salmonella gallinarum	10,5	12,0	14,0	16,5	0	0	0	0
Alcaligenes faciens	9,0	10,0	12,0	14,0	0	0	0	0
Comamonas acidovorans	10,0	12,0	13,0	15,0	0	0	0	0
Escherichia coli	10,0	11,0	12,5	12,5	0	0	0	0
Proteus vulgaris	9,0	10,0	11,5	14,0	0	0	0	0
Serratia marcescens	10,0	11,0	14,0	18,0	0	0	0	0
Pseudomonas aeruginosa	9,0	11,0	12,5	13,0	0	0	0	0
Aspergilus niger	10,0	12,0	15,0	17,0	0	0	0	0
Fusarium oxysporum	9,0	10,0	12,0	14,0	0	0	0	0
Candida guallermondii	10,0	12,0	14,0	17,0	0	0	0	0
Rhodotorula aurantiaca	10,0	13,0	15,0	16,0	0	0	0	0

Результаты исследований по применению нового бактериоцина ЛГС и культуральной жидкости его продуцента в качестве консервантов показали, что по мере хранения в контрольном образце мяса, упакованного в пленку без какой-либо обработки, наблюдали постепенное увеличение обсемененности после 7 сут хранения, а на 45-е сут КМАФАнМ достигло значения 3,6 х10⁶ КОЕ/г, к 85 сут хранения - 1,0х10⁸ КОЕ/г. Общая обсемененность образцов мяса, обработанных 0,25%-ным покрывающим раствором ППС-10, составила за 45 сут хранения 3,8х10⁵ КОЕ/г, а в сочетании с молочной кислотой 9,2х10⁴ КОЕ/г. КМАФАнМ образцов мяса, обработанных бактериоцином ЛГС, было минимальным и составило 3,6х10⁴ КОЕ/г, в сочетании с аскорбиновой кислотой - 7,8 х10³ КОЕ/г, но дрожжевые клетки не были обнаружены, по внешнему виду и органолептическим показателям мясо соответствовало свежему мясу. Установлено, что обработка образцов мяса всеми консервирующими агентами способствовала снижению бактериальной обсемененности охлажденного мяса, однако при использовании бактериоцина ЛГС и культуральной жидкостью штамма F-116 консервирующий эффект более очевиден по сравнению с низаплином и лизоцимом - КМАФАнМ снизилось почти на четыре порядка. Использование низаплина для обработки мяса, рН которого составлял 5,8-6,2, и хранении его при пониженных температурных режимах менее эффективно по сравнению с бактериоцином ЛГС и лизоцимом.

Изучение санитарно-микробиологического состояния сырья показало, что в контрольном образце и в образцах, обработанных лизоцимом, низаплином после 45 сут хранения были обнаружены Pseudomonas aeruginosa, которые в ультрафиолетовом свете на МПА дают характерное зеленое свечение, при росте в МПБ вызывали помутнение и образовывали пленку, а на среде Рессель изменяли цвет скошенного агара без образования газа [8]. В контрольных образцах мяса (без обработки консервантами) после 45 сут хранения были обнаружены энтерококки, анаэробные гнилостные бактерии, вызывающие неприятный запах, изменение цвета до серого и ослизнение образцов. Обсемененность этими микроорганизмами сохранялась и в последующие 30 дней хранения. В образцах, обработанных ППС-10 с молочной кислотой, после 45 дней хранения обнаружен рост Staphylococcus aureus , что подтвердила реакция плазмокоагуляции (РПК). Во всех образцах, за ислючением обработанных бактериоцином ЛГС, культуральной жидкостью штамма F-116 и лизоцимом, после 85 дней хранения были обнаружены дрожжи и плесени (отмечено ослизнение поверхности мяса, количество дрожжей достигло 1,5х10⁴.КОЕ/г) (табл. 2).

Таблица 2 Изменение общей бактериальной обсемененности образцов мяса говядины, обработанных консервантами, в процессе хранения

Консервант	Общая бактериальная обсемененность (КОЕ/г)
	Длительность хранения, сут
Контроль (без обработки)	1	7	15	25	35	45	65	85
	3,5х103	5,5х102	1,0х103	7,2х104	2,1х106	3,6х106	4,0х107	1,0х108
Низаплин 2,5 мг/мл	4,2х102	1,5х103	1,1х103	6,2х103	2,6х104	7,1х104	2,8х105	5,2х106
Бактериоцин ЛГС 2,5 мг/мл	3,3х103	6,3х102	1,9х103	1,9х103	3,3х103	1,8х104	8,6х104	3,6х104
Культуральная жидкость L.lactis F-116	2,6х105	5,0х105	1,2х106	3,3х103	9,9х104	3,5х104	3,6х104	5,4х105
ППС-10 1,5% + 2% молочной кислоты	7,7х102	1,0х103	1,0х103	5,0х103	1,7х104	9,2х104	5,2х106	4,2х107

Результаты исследований по использованию бактериоцина ЛГС для консервирования рыбы показали, что за 10 дней хранения уровень бактериальной обсемененности образцов рыбы, обработанной данным бактериоцином, значительно ниже: от 7,2х108 КОЕ/г (в контроле) до 2,3х104 КОЕ/г, а за 15 дней - от 2,1х1010 КОЕ/г (в контроле) до 2,6х1045КОЕ/г. Бакте-риоцин ЛГС, как и культуральная жидкость продуцента, являлся более эфективным по сравнению с использованием лизоцима, консервантов ППС-10 и молочной кислоты (табл. 3).

Таблица 3

Изменение общей бактериальной обсемененности образцов рыбы, обработанных консервантами, в процессе хранения

Образец+ консервант	Общая обсемененность, КОЕ/г
	Длительность хранения, дни
	0	5	10	15
Контроль	9,8х105	6,5х106	7,2х108	2,1х1010
Лизоцим. 2,5 мг/мл	8,45х10 5	2,9х106	2,8х108	4,8х108
Низаплин. 2,5 мг/мл	3,6х10 5	7,4х10 5	6,0х107	7,3х108
Бактериоцин ЛГС. 2,5 мг/мл	9,9х104	2,0х10 5	2,3х104	2,6х10 5
Культуральная жидкость. L. lactis F-116	4,2х106	6,0х107	8,2х108	7,3х10 5
ППС-10 +молочная кислота	8,3х104	4,4х10 5	2,2х108	3,9х108

Выводы

Показана перспективность штамма, полученного методом слияния протопластов, обепе-чивающего создание активных продуцентов широкого спектра антимикробного действия с уникальными свойствами. Получен новый нетоксичный консервант широкого спектра антибактериального и фунгицидного действия, продуцируемый гибридным штаммом Lactococcus lactis ssp . lactis F-116. Препарат является эффективным по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям, развивающимся в пищевом сырье при хранении. Очевидна перспективность его использования для увеличения сроков хранения продуктов и сырья, что поможет пищевой промышленности отказаться от применения дорогостоящих химических консервантов, антибиотиков и удовлетворит требованиям покупателей к безопасности пищевых продуктов.