Биопрепарат на основе штамма Lactobacillus plantarum l-211 для животноводства. Сообщение I. Кормлениe бройлеров

Для обеспечения высокой продуктивности птицы необходимы полноценные и сбалансированные по всем питательным веществам комбикорма. Особое значение имеет лизин, который относится к группе незаменимых лимитирующих аминокислот. В растительных кормах он содержится в незначительных количествах, поэтому в рационах животных и птицы его часто не хватает, особенно при преимущественном использовании зерновых злаков, подсолнечного шрота и незначительной доле (1-2 %) животных кормов. В рационах пшенично-ячменного и кукурузно-подсолнечного типа дефицит лизина может достигать 15-20 %. Поэтому для балансирования рационов широко используют синтетический лизин (1-3).

Как известно, введение синтетических аминокислот в рацион сопряжено с неизбежным количественным ограничением: их быстрое всасы-

^∗ Работа выполнена в рамках соглашения с Министерством образования и науки Российской Федерации о предоставлении субсидии от 05.06.2014 г. ¹ 14.579.21.0021 (RFMEFI57914X0021).

вание в кровь (в сравнении с аминокислотами, поступающими из растительных или животных кормов в процессе пищеварения) приводит к дисбалансу аминокислот в организме птицы и негативно отражается на продуктивности. Синтетический лизин в форме монохлоргидрата приводит к избыточному содержанию хлора в комбикормах и, как следствие, к его дисбалансу, что также негативно влияет на продуктивность (4).

В настоящее время во многих странах в рационах птицы используют кормовые добавки на основе бактерий, продуцирующих аминокислоты и другие жизненно необходимые вещества (5-7). При изучении действия отечественного бактериального препарата Пролизэр-БиоР установлена эффективность замены синтетического лизина его продуцентом — штаммом Escherichia coli (8-10). Однако E. coli — представитель условно-патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта. У цыплят при ослаблении иммунитета кишечная палочка становится причиной колибактериоза (11-13). Несмотря на то, что в наших исследованиях с продуцентом лизина на основе непатогенного штамма E. coli не наблюдалось случаев колибактерио-за (14), задача поиска продуцентов лизина на основе непатогенной микрофлоры, к которой относятся лактобактерии, не утрачивает актуальности.

Штамм Lactobacillus plantarum L-211 был идентифицирован до вида с помощью анализа генов 16S рРНК с гомологией 99 %. Фенотипически штамм L. plantarum L-211 — это мелкие неспорообразующие мезофильные факультативно-анаэробные грамположительные палочковидные бактерии. По биохимическим признакам микроорганизм каталазоотрицательный, не образующий CO₂ из глюкозы, сероводород и индол, разжижающий желатину, обладающий нитратредуктазной активностью, восстанавливающий лакмусовое молоко, гидролизующий L-аргинин и сбраживающий большинство углеводов. По технологическим свойствам L. plantarum L-211 имеет энергию кислотообразования за 24 ч 80 ° Т, предел кислотообразования — 140 ° Т (7 сут). Микроорганизм не декарбоксилирует аминокислоты, следовательно, не образует биогенных аминов — гистамина, тирамина, путресцина, кадаверина. L. plantarum L-211 способен продуцировать лизин (в среднем 148,4±4,45 мг/л) при культивировании в минеральной среде (14).

В представляемой работе мы впервые показали возможность оптимизировать микрофлору желудочно-кишечного тракта птицы и ее обеспеченность аминокислотами (в том числе лизином) при использовании биопрепарата на основе штамма L. plantarum L-211.

Нашей целью было изучение влияния продуцента лизина — штамма L. plantarum L-211 на состав бактериального сообщества кишечника и продуктивные показатели у цыплят-бройлеров.

Методика. Объектом исследования были четыре группы бройлеров (Gallus gallus L.) кросса Соbb 500 (по 35 гол. в каждой) в период с 1- до 35-суточного возраста (виварий ФГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП», Московская обл.). Цыплят I группы (контроль) кормили рассыпными комбикормами, сбалансированными по всем питательным веществам (ОР) в соответствии с нормами Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства (ВНИТИП) (1). Птица во II группе получала ОР и пробиотик на основе штамма L. plantarum L-211 (ООО «Биореактор», г. Москва; 1 мл • гол.-1 • сут-1), в III группе — ОР с добавкой отечественного препарата на основе L. plantarum (1 мл • гол.-1 • сут-1), в IV — ОР и отечественный пробиотический препарат на основе Bacillus subtilis (2 мл • гол.-1 • сут-1). Для каждого из препаратов количество живых микроорганизмов — 100 млн КОЕ/мл. Цыплят содержали в клеточных батареях Avi-Max («Big Dutchman International GmbH», Германия) без разделения по полу, с соблюдением технологических параметров согласно нормам ВНИТИП.

В период опыта учитывали основные зоотехнические показатели: живую массу птицы в 7-, 14-, 21-, 28-суточном возрасте и к окончанию выращивания (индивидуальное взвешивание поголовья), сохранность поголовья, среднесуточный прирост живой массы, потребление и затраты корма на 1 кг прироста живой массы. В физиологическом балансовом опыте на 35-суточных цыплятах-бройлерах определяли переваримость протеина, жира, использование азота, кальция, фосфора, доступность метионина и лизина (15, 16).

Содержимое слепых отростков кишечника для молекулярно-генетических исследований отбирали при убое птицы в 35-суточном возрасте со строгим соблюдением стерильности по установленным требованиями (16). Состав бактериального сообщества слепых отростков исследовали методом Т-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) (17, 18). Тотальную ДНК для Т-RFLP анализа выделяли из образцов с помощью набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва) согласно рекомендациям производителя. ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе Verity («Life Technologies, Inc.», США), используя эубактериальные праймеры: 63F — CAGGCCTAACACATGCAAGTC с меткой на 5´-конце (флуорофор WellRed D4, «Beckman Coulter, Inc.», США) и 1492R — TACGGHTACCTTGTTA-CGACTT. Флуоресцентно меченные ампликоны ДНК гена 16S pРНК очищали по стандартной методике (18). Полученные ампликоны (30-50 нг) ре-стрицировали эндонуклеазами HaeIII, HhaI и MspI, следуя рекомендации изготовителя («Fermentas, Inc.», Литва). Продукты рестрикции исследовали с помощью системы генетического анализа CEQ™ 8000 («Beckman Coulter Inc.», США) согласно рекомендациям производителя. Для определения филогенетической принадлежности бактерий применяли программу Fragment Sorter .

Статистическую обработку результатов проводили с помощью дисперсионного анализа в программе Microsoft Excel 2010. Рассчитывали средние ( X ) и ошибки средних ( х ). Различия с контролем считали значимыми при Р < 0,05; Р < 0,01 и Р < 0,005.

Результаты. Кормление цыплят осуществляли вручную, вволю, сухими полнорационными комбикормами в соответствии с нормами для кросса по ОР согласно нормам ВНИТИП (табл. 1).

1. Рецепты экспериментальных комбикормов (основной рацион) для цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 разного возраста

Период выращивания
Компонент, %	1-21-е сут	22-35-е сут
Пшеница	42,57	55,20
Кукуруза	10,00	0
Жмых подсолнечный кормовой (содержание протеина 34 %)	9,86	7,18
Соевое масло	2,65	5,00
Холинхлорид	0,07	0,07
Соя полножирная кормовая (содержание протеина 34 %)	25,00	23,94
Рыбная мука кормовая (содержание протеина 65 %)	7,00	6,00
Метионин кормовой (не менее 99 %)	0,27	0,23
Лизин кормовой (не менее 78 %)	0,41	0,27
Монокальцийфосфат кормовой	0,47	0,59
Известняк	1,36	1,13
NaCl	0,24	0,29
Премикс (ВНИТИП, Россия)	0,10	0,10
Всего содержание в 100 г комбикорма, %:
сухое вещество	86,45	84,30
обменная энергия, ккал	310	320
сырой протеин	22,50	21,00
жир	9,82	11,46
линолевая кислота	4,68	5,52
сырая клетчатка	5,05	4,63
лизин	1,45	1,25

Продолжение таблицы 1

метионин	0,66	0,58
метионин + цистин	0,99	0,89
треонин	0,80	0,74
триптофан	0,26	0,25
Са	1,00	0,89
Р	0,68	0,67
Р усвояемый	0,39	0,39
Na	0,20	0,20
К	0,72	0,69
Cl	0,34	0,33
холин	0,05	0,05

По результатам T-RFLP-анализа (табл. 2), у бройлеров из всех групп идентифицировали микроорганизмы 5 филумов, включая Firmicutes , Bacteroidetes , Actinobacteria , Proteobacteria и Fusobacteria , что согласуется с исследованиями микробиома содержимого слепых отростков, проведенными ранее (19-21). Доминирующими в исследуемых микробных сообществах были представители филума Firmicutes , включающего преимущественно бактерии с целлюлозо- и амилолитическими свойствами из класса Clostridia (в том числе семейств Ruminococcaceae , Eubacteriaceae , Lachnospi-raceae , Clostridiaceae и др.), микроорганизмы порядка Negativicutes , утилизирующие кислоты, а также бактерии семейств Bacillaceae и Lactobacillace-ae . Бактерии других филумов присутствовали в меньших количествах.

Среди условно-патогенных и патогенных микроорганизмов у исследуемых цыплят обнаружили бактерии из семейств Campylobacteriaceae , Enterobacteriaceae , Pasterellaceae , Actinobacteriaceae , филы Fusobacteria , а также родов Peptococcu s и Staphylococcus .

2. Cоотношение бактериальных таксонов (%) в слепых отростках кишечника у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 в возрасте 35 сут при введении в рацион препаратов пробиотиков ( Х ± х , виварий ФГУП «Загорское ЭПХ ВНИ-ТИП», Московская обл.)

Таксон I группа (контроль, n = 3) II группа (n = 3) III группа (n = 3) IV группа (n = 3) Фила Bacteroidetes 2,04±0,10 3,01±0,12** 2,76±0,14* 2,65±0,10* Фила Firmicutes 53,71±2,43 60,17±2,84 43,28±2,11* 63,80±3,01 класс Clostridia 31,14±1,15 35,08±1,26 21,74±1,01** 40,14±1,98* род Peptococcus 2,36±0,14 1,75±0,05* 1,27±0,07** 1,94±0,08 род Lactobacillus 1,72±0,08 6,63±0,31*** 11,00±0,49*** 10,60±0,60*** род Bacillus 10,60±0,43 6,45±0,23** 4,40±0,21*** 3,34±0,14*** род Staphylococcus 0,67±0,23 0,46±0,21 0,38±0,14 0,26±0,11 порядок Negativicutes 7,22±0,29 9,80±0,42* 4,49±0,19** 7,52±0,39 Фила Actinobacteria 2,82±0,13 7,76±0,30*** 2,43±0,12 6,11±0,30*** семейство Bifidobacteriaceae 0,12±0,01 Н.п.д.о. 0,07±0,01* 0,04±0,01** Фила Proteobacteria 29,29±1,14 13,40±0,59** 25,47±1,02 15,06±0,62*** семейство Enterobacteriaceae 14,10±0,65 6,04±0,29*** 15,70±0,78 1,07±0,04*** семейство Сampylobacteriaceae 2,08±0,09 2,23±0,06 1,92±0,08 1,47±0,06** семейство Pseudomonadaceae 9,43±0,58 1,71±0,05*** 5,12±0,09** 8,12±0,27 семейство Pasteurellaceae 1,32±0,22 1,76±0,11 1,46±0,12 2,46±0,42 Фила Fusobacteria 2,58±0,14 2,52±0,12 1,56±0,10** 2,18±0,17 Неклассифицированные последовательности 9,56±0,59 13,05±0,65 24,50±1,21*** 10,20±0,52 П р и м е ч а н и е. Во II, III и IV группах к основному (контрольному) рациону добавляли препараты пробиотиков на основе соответственно Lactobacillus plantarum L-211, L. plantarum и Bacillus subtilis (подробнее см. в разделе «Методика»). Н.п.д.о. — ниже предела достоверного определения методом T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism).

*, **, *** — различия с контролем статистически значимы соответственно при Р < 0,05; Р < 0,01 и Р<0,005.

Мы установили, что введение в рацион бройлеров живых культур пробиотических бактерий приводило к изменению количества выявленных таксонов в содержимом слепых отростков, которое имело сходные тенденции для птицы из опытных групп. Так, у цыплят, в рацион которых вводились пробиотики, доля бактерий рода Lactobacillus, обладающих, как правило, значительными антагонистическими свойствами против патогенных видов благодаря синтезу антимикробных соединений (22, 23), существенно повышалась: в 3,88 (Р < 0,005), 6,40 (Р < 0,005) и 6,12 раза (Р < 0,005) соответственно для II, III и IV групп по сравнению с контролем. Содержание других бактерий, имеющих сходные свойства в отношении патогенов, — бацилл у птицы во всех группах по сравнению с контролем снижалось соответственно в 1,13 (Р < 0,01), 1,43 (Р < 0,005) и 1,29 (Р < 0,005) раза. Кроме того, у бройлеров из этих групп численность бактерий филы Bacter-oidetes, связанных с процессами ферментации углеводов корма вследствие способности продуцировать амилолитические и целлюлозолитические ферменты, по группам повышалась относительно контроля в 1,48 (Р < 0,01), 1,35 (Р < 0,05) и 1,30 (Р < 0,05) раза.

Однако в отношении других бактерий, также обладающих амило- и целлюлозолитическими свойствами (класс Clostridia ), действие изучаемых препаратов было неодинаковым. Включение в рацион продуцента лизина L . plantarum L-211 и B. subtilis способствовало повышению доли бактерий из класса Clostridia соответственно в 1,13 и 1,29 (Р < 0,05) раза, тогда как скармливание L. plantarum , не продуцирующего лизин, напротив, снижало этот показатель в 1,43 раза (Р < 0,01) по сравнению с контролем. Эффект препарата на основе L . plantarum L-211 в отношении представителей класса Clostridia согласуется с данными зарубежных авторов, которые показали, что недостаток лизина в рационах птицы приводит к сокращению представленности рода Eubacterium в слепых отростках кишечника (24).

Аналогичную тенденцию отмечали в отношении бактерий из порядка Negativicutes , утилизирующих кислоты. Введение в рационы продуцента лизина приводило к росту их доли в 1,36 раза (Р < 0,05), тогда как препарата на основе не синтезирующего лизин штамма лактобактерий — к ее уменьшению в 1,61 раза (Р < 0,01) относительно контроля.

Следует отметить, что введение в рацион пробиотических препаратов способствовало снижению численности ряда патогенов в слепых отростках желудочно-кишечного тракта. Так, все препараты приводили к уменьшению доли патогенов, вызывающих гнойно-некротические инфекции у цыплят: пептококков — в 1,35 (Р < 0,05), 1,86 (Р < 0,01) и 1,22 раза, стафилококков — в 1,46; 1,76 и 2,58 раза соответственно во II, III и IV группах. Кроме того, продуцент лизина сократил содержание энтеробактерий, вызывающих гастроэнтериты у птицы, в 2,33 раза (Р < 0,005) в сравнении с контролем. Эффективным в отношении энтеробактерий и кампи-лобактерий (возбудители гастроэнтерита), а также фузобактерий (возбудители гнойно-некротических инфекций у животных и птицы) оказался препарат B. subtilis , в результате применения которого численность указанных патогенов снизилась соответственно в 13,17 (Р < 0,005), 1,41 (Р < 0,01) и 1,18 раза по отношению к контролю. Пробиотик на основе не синтезирующих лизин лактобактерий был эффективен в отношении фузобактерий, доля которых снижалась в 1,65 раз (Р < 0,01) по сравнению с контролем.

В то же время в отношении некоторых патогенов пробиотического эффекта от применения препаратов не наблюдали. Так, у цыплят из II и IV групп отмечалась тенденция к повышению доли пастерелл (вызывают респираторные инфекции у цыплят) соответственно в 1,33 и 1,76 раза, а также нежелательных актиномицетов (некоторые представители могут быть причиной актиномикозов) — в 2,75 (Р < 0,005) и 2,16 раза (Р < 0,005).

Интересен тот факт, что при применении пробиотических препаратов содержание представителей семейства Pseudomonadaceae , которые относятся к транзитным микроорганизмам, поступающим в организм с кормом, снижалось в слепых отростках кишечника бройлеров в 5,51 (Р < 0,005); 1,84 386

(Р < 0,01) и 1,16 раза, а неидентифицированных таксонов — возрастало в 1,25; 2,18 (Р < 0,005) и 1,08 раза соответственно во II, III и IV группах.

3. Основные зоотехнические показатели у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 в возрасте 35 сут при введении в рацион препаратов пробиотиков ( Х ± х , виварий ФГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП», Московская обл.)

Показатель	I группа (контроль, n = 3)	II группа ( n = 3)	III группа ( n = 3)	IV группа ( n = 3)
Сохранность поголовья, %	97,1	94,3	100	97,1
Живая масса в разном возрасте, г:
1 сут	40,0±1,98	40,0±2,18	40,00±2,14	40,00±1,16
7 сут	120,22±2,88	112,22±3,25	117,44±2,77	114,22±2,84
14 сут	323,21±7,90	315,24±7,54	323,45±8,39	309,63±8,50
21 сут	708,42±13,72	668,42±14,44	698,16±14,95	671,58±14,35
28 сут	1128,0±36,89	1054,57±22,2	1110,14±38,30	1142,57±26,60
35 сут	1697,65±39,27	1739,68±33,17	1691,33±32,38	1687,20±39,85
в том числе у петушков	1882,50±38,97	1947,0±42,84	1900,0±26,42	1927,501±37,17
в том числе у курочек	1533,34±32,98	1640,95±23,06*	1587,0±22,74	1574,2±26,86
в среднем	1707,92±35,16	1793,5±33,19	1743,5±25,81	1750,85±31,45
Затраты корма на 1 гол., кг	2,748	2,779	2,681	2,635
Затраты корма на 1 кг прироста, кг	1,657	1,635	1,624	1,599
Среднесуточный прирост, г	49,05	51,57	50,10	50,32

П р и м е ч а н и е. Во II, III и IV группах к основному (контрольному) рациону добавляли препараты пробиотиков на основе соответственно Lactobacillus plantarum L-211, L. plantarum и Bacillus subtilis (подробнее см. в разделе «Методика»).

* Различия с контролем статистически значимы при Р < 0,05.

Сохранность птицы (табл. 3) варьировала (с разницей 3,7 %) в зависимости от применяемого препарата и оказалась наибольшей в III группе, где этот показатель был на 2,9 % выше, чем в контроле и в IV группе, и на на 5,7 % выше, чем в III группе. Динамика живой массы также различалась в зависимости от группы: до 28-суточного возраста наибольшую имели бройлеры из I группы (контроль), на 35-е сут — из II группы, где в рацион вводили продуцент лизина L. plantarum L-211. Средняя живая масса цыплят II группы в сравнении с контролем была выше на 5,01 %, петушки по живой массе превосходили контрольных аналогов на 3,4 %, курочки — на 7,0 % (Р < 0,05). При этом затраты корма на 1 кг прироста живой массы во II группе снижались и составили 1,635 кг против 1,657 кг в контроле. Возможно, более низкие зоотехнические показатели по живой массе у цыплят из II опытной группы в первый период выращивания связаны с применением препарата на фоне нормативного содержания лизина в рационе, что требует дополнительных исследований по корректировке дозировок.

Необходимо отметить некоторое отставание по живой массе в III группе, получавшей не синтезирующий лизин штамм L. plantarum , относительно контрольной птицы, которое наблюдали в первый период откорма, что связано прежде всего с большим числом курочек в группе. Во второй период средняя живая масса бройлеров в III группе превышала аналогичный показатель в контроле на 2,08 % (для петушков и курочек — соответственно на 0,93 и 3,50 %). При этом затраты корма на 1 кг прироста живой массы были ниже контрольных на 1,99 %.

В IV группе, где дополнительно к ОР скармливали препарат B. sub-tilis , скорость роста цыплят к 28-м сут выращивания оказалась выше, по живой массе они превосходили I группу (превышение контрольных значений на 1,30 %, к концу откорма — на 2,51 %). Введение в рацион препарата на основе B. subtilis также позволило получить самые низкие затраты корма на 1 кг прироста живой массы — 1,599 кг против 1,657 кг в I группе.

Результаты физиологического (балансового) опыта (табл. 4) в целом согласовывались с данными по продуктивности бройлеров. Так, во всех опытных группах переваримость сухого вещества корма и питательных веществ рациона имела тенденцию к снижению по сравнению с кон-387

тролем. Мы отмечали более низкую переваримость протеина, сухого вещества корма, жира и использование азота у цыплят из II-IV групп, что указывает на необходимость скорректировать способ применения и дозировки пробиотиков (например, использовать режим прерывистой выпойки). Отметим, что применение в рационе бройлеров III группы не синтезирующего лизин штамма L. plantarum способствовало повышению переваримости клетчатки на 0,5 % по сравнению с контролем.

4. Использование питательных веществ корма (%) у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 в возрасте 35 сут при введении в рацион препаратов пробиотиков ( Х ± х , виварий ФГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП», Московская обл.)

Показатель	I группа (контроль, n = 3)	II группа ( n = 3)	III группа ( n = 3)	IV группа ( n = 3)
Переваримость, %: протеина	94,7±1,12	92,20±1,32	93,90±0,98	93,10±1,19
сухого вещества корма	73,7±1,26	67,00±0,67	71,00±1,24	69,60±1,14
жира	83,2±1,01	80,20±1,85	81,30±2,13	80,10±0,95
клетчатки	29,5±1,14	21,00±0,96	30,00±1,43	24,40±1,32
Использование, %: азота	66,7±1,16	61,30±2,01	61,70±1,95	60,00±1,39
кальция	48,0±2,14	49,30±1,56	48,60±1,04	47,70±1,54
фосфора	44,9±1,75	47,90±1,22	44,50±2,01	42,80±1,95
Доступность, %: лизина	92,8±1,13	90,10±0,95	93,80±0,68	94,40±1,16
метионина	84,1±1,05	80,10±1,65	77,10±1,25	78,80±1,82

П р и м еч а ни е. Во II, III и IV группах к основному (контрольному) рациону добавляли препараты пробиотиков на основе соответственно Lactobacillus plantarum L-211, L. plantarum и Bacillus subtilis (подробнее см. в разделе «Методика»).

Более высокую доступность лизина отмечали у цыплят из III и IV опытных групп, которые получали препараты бактерий, не способных продуцировать лизин (93,8 и 94,4 % против 92,8 % в контроле).

Таким образом, применение в рационе птицы L. plantarum L-211 вы-раженно влияет на бактериальное сообщество в слепых отростках кишечника. В отличие от двух других исследованных бактериальных препаратов штамм L. plantarum L-211 способствует одновременному росту доли целлю-лозо- и амилолитических бактерий класса Clostridia и бактерий порядка Negativicutes . Кроме того, он обладает пробиотической активностью, действуя положительно на численность лактобактерий и снижая представленность условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (включая пепто-кокки, стафилококки, энтеробактерии). Следует отметить, что биопрепарат на основе L. plantarum L-211 не снижал содержания фузобактерий, которые подавлял не синтезирующий лизин штамм лактобактерий, а также кам-пилобактерии, против которых был эффективен препарат на основе B. subtilis . В отношении некоторых патогенов пробиотического эффекта от препаратов не отмечали. При этом применение L. plantarum L-211 приводило к повышению доли пастерелл и актиномицетов в сравнении с контролем.

Итак, наши исследования подтвердили возможность применения пробиотика на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211 для улучшения продуктивности бройлеров. Препарат на основе продуцента лизина продемонстрировал наилучшие результаты по средней живой массе на 35-е сут выращивания и среднесуточному приросту у цыплят. При этом у птицы, получавшей препараты, не обладающие способностью к синтезу лизина, его доступность была выше. Влияние изученных пробиотиков на состав сообщества патогенных, условно-патогенных, транзитных микроорганизмов и актиномицетов в слепых отростках кишечника бройлеров различалось в зависимости от бактериального препарата и периода выращивания, что указывает на возможность повысить эффективность пробиотических добавок за счет корректировки режимов и доз их введения в рацион.