Биопрепарат на основе штамма Lactobacillus plantarum l-211 для животноводства. Сообщение II. Кормлениe поросят

В период доращивания поросят происходит формирование их пищеварительной системы и интенсивный прирост живой массы, что важно для получения высокопродуктивного поголовья (1, 2). При этом особую роль играет полноценный аминокислотный состав рациона, в том числе по эссенциальным аминокислотам. С недостатком лизина связано снижение аппетита и продуктивности животных, потеря массы тела, нарушение кальцификации костной ткани, общее истощение и анемия (3, 4). Кроме того, происходит подавление иммунитета и повышается восприимчивость к инфекционным заболеваниям (5). Из-за дефицитности кормосмесей растительного происхождения по лизину их использование в кормлении свиней непродуктивно. Основным сырьем при производстве отечественных комбикормов для свиней служат дефицитные по лизину компоненты (зерновые, побочные продукты их переработки, подсолнечный шрот), поэтому,

^∗ Работа выполнена в рамках соглашения с Министерством образования и науки Российской Федерации о предоставлении субсидии от 05.06.2014 г. ¹ 14.579.21.0021 (RFMEFI57914X0021).

как правило, не удается обеспечить норму по лизину без использования синтетических аминокислот, что значительно удорожает комбикорма (6, 7).

Разработки биопрепаратов (пробиотиков), синтезирующих лизин в желудочно-кишечном тракте животных (8, 9) при скармливании, которые выполняются в России и за рубежом, рассматриваются как наиболее перспективный подход при формировании оптимальной кишечной микрофлоры. При этом в качестве продуцентов лизина преимущественно изучались Brevibacterium lactofermentum , E. coli и представители рода Corynebacterium (1012), однако перечисленные микроорганизмы относятся к условно-патогенным и способны вызывать оппортунистические инфекции, вследствие чего их использование в качестве пробиотиков крайне нежелательно. Некоторые штаммы рода Lactobacillus также способны синтезировать лизин (8, 9, 13) и позитивно влияют на рост, качество туши, иммунитет животных (14, 15). Положительный эффект от применения лактобактерий в рационах свиней также связывают с синтезом органических кислот и бактериоцинов, подавляющих рост и развитие различных возбудителей заболеваний — сальмонелл, протеев, стафилококков, кишечной палочки, псевдомонад, стрептококков (15, 16).

В последние годы сообщается об успешном применении молекулярно-генетических подходов для изучения микробного сообщества пищеварительного тракта свиней, в том числе продемонстрированы различия в составе микробиоценоза здоровых свиней и животных с кишечными расстройствами (17, 18). Методы T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) и NGS (next generation sequencing) позволяют дать развернутую характеристику микробного сообщества, выявляя не только таксономические доминанты, но и минорные компоненты, в том числе некультивируемые микроорганизмы, доля которых в разных экосистемах может достигать 90 % (19, 20). Однако проведенные до настоящего времени исследования кишечного микробиома свиней единичны (21, 22), а данные относительно комплексного анализа бактериального сообщества и воздействия на него пробиотических штаммов лактобактерий отсутствуют. Штамм Lactobacillus plantarum L-211 описан как продуцент лизина с достаточно высоким выходом при культивировании (8, 9).

Мы впервые с помощью метода T-RFLP определили состав бактериального сообщества в толстом отделе кишечника поросят при выпаивании препарата лизин-продуцирующего штамма лактобактерий и выявили его высокую пробиотическую активность, что сопровождалась положительными изменениями зоотехнических показателей — повышением сохранности и среднесуточного прироста живой массы.

Целью настоящей работы было изучение влияния продуцента лизина — штамма Lactobacillus plantarum L-211 на бактериальное сообщество кишечника и продуктивные показатели у поросят в период доращивания.

Методика. Производственный опыт проводили на двух группах поросят породы крупная белая в период с 28- до 84-суточного возраста (ООО «Новгородский Бекон», Новгородская обл.). Содержание и кормление поросят из I (контроль, n = 715) и II ( n = 657) групп осуществляли с соблюдением всех технологических показателей при равноценных составах комбикормов (ООО «Новгородский бекон», Новгородская обл.) по лизину, соответствующих нормам для породы крупная белая. Поросятам II группы дополнительно один раз в 7 cут выпаивали препарат на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211 (ООО «Биореактор», г. Москва) в количестве не менее 10⁹ КОЕ/гол. Учитывали сохранность поголовья, живую массу поросят в возрасте 28 и 84 сут (индивидуальное взвешивание), ее среднесуточный прирост, потребление и затраты корма на 1 кг живой массы.

Отбор содержимого толстого отдела кишечника от трех поросят из каждой группы для молекулярно-генетических исследований проводили в 84-суточном возрасте при убое со строгим соблюдением стерильности. TRFLP-анализ состава бактериального сообщества проводили согласно описанию (23). Тотальную ДНК из образцов выделяли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва) согласно рекомендациям производителя. ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе Verity («Life Technologies, Inc.», США) с эубактериальными праймерами: 63F — CAGG-CCTAACACATGCAAGTC с меткой на 5´-конце (флуорофор WellRed D4, «Beckman Coulter, Inc.», США), 1492R — TACGGHTACCTTGTTACGACTT. Флуоресцентно меченные ампликоны ДНК гена 16S pРНК очищали в соответствии с описанием (24), рестрикцию (30-50 нг) эндонуклеазами HaeIII, HhaI и MspI выполняли, следуя рекомендации изготовителя («Fermentas, Inc.», Литва). Продукты рестрикции анализировали с помощью CEQ™ 8000 («Beckman Coulter Inc.», США) согласно инструкции производителя. Принадлежность бактерий к филогенетической группе определяли в программе Fragment Sorter .

Данные обрабатывали с помощью дисперсионного анализа. Различия с контролем считали значимыми при Р < 0,05; Р < 0,01 и Р < 0,001.

Результаты . T-RFLP анализ микробного сообщества толстого отдела кишечника поросят, где с участием кишечной микробиоты происходят важнейшие биохимические процессы переваривания углеводов корма, в том числе клетчатки, с образованием летучих жирных кислот (ЛЖК) и других метаболитов (25), выявил ряд таксономических групп (табл. 1).

1. Cоотношение бактериальных таксонов (%) в толстом отделе кишечника у 84-суточных поросят породы крупная белая при выпаивании препарата на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211 ( Х ± х , ООО «Новгородский бекон», Новгородская обл.).

Идентифицированные бактерии принадлежали к пяти филумам, из которых преобладали представители филу-ма Firmicutes , в том числе из класса Clostridia и порядка Ne-gativicutes . Традиционно бактерии семейств Lachnospiraceae , Clostridiaceae , Ruminococcaceae , Eubacteriaceae , относящиеся к классу Clostridia , считают основными источниками ферментов (целлюлаз, гемицел-люлаз, амилаз и др.), необходимых для метаболизма углеводов растительных кормов. Как правило, образующиеся при этом ЛЖК используются представителями порядка Ne-gativicutes, включая бактерии родов Megasphaera , Selenomo-nas и др. Отметим, что указанные процессы ранее описаны преимущественно для жвачных (25). Менее были представлены филумы Proteobacteria , Bacteroidetes , Actinobacteria и Fusobacteria .

Таксон	I группа (контроль, n = 3)	II группа (опыт, n = 3)
Фила Bacteroidetes	0,17±0,01	0,90±0,04**
Фила Firmicutes	35,46±1,69	65,38±2,95**
класс Clostridia	5,35±0,21	10,96±0,43**
семейство Lachnospiraceae	1,48±0,06	0,69±0,03**
семейство Eubacteriaceae	1,07±0,04	8,18±0,03***
семейство Ruminococcaceae	0,84±0,03	0,47±0,02**
cемейство Clostridiaceae	1,89±0,09	1,62±0,07
род Peptostreptococcus	0,07±0,01	Н.п.д.о.
род Lactobacillus	7,83±0,33	23,07±1,13**
род Bacillus	2,93±0,13	9,65±0,61**
род Staphylococcus	0,25±0,01	Н.п.д.о.
порядок Negativicutes	19,10±0,97	21,70±1,03
Фила Actinobacteria	0,16±0,01	Н.п.д.о.
Фила Proteobacteria	2,04±0,03	2,64±0,06**
семейство Enterobacteriaceae	0,87±0,23	1,95±0,15*
семейство Сampylobacteriaceae	0,21±0,01	Н.п.д.о.
семейство Pseudomonadaceae	0,96±0,04	0,21±0,01***
род Acinetobacter	Н.п.д.о.	0,48±0,02
семейство Pasteurellaceae	2,60±0,14	1,84±0,08*
Фила Fusobacteria Неклассифицированные	0,07±0,01	0,14±0,01*
последовательности	59,49±2,98	29,10±1,39**
П р и м еч а ни е. Описание групп см. в разделе «Методика».
Н.п.д.о. — ниже предела достоверного определения методом
T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism).
*, **, *** — различия с контролем статистически ветственно при Р < 0,05; Р < 0,01 и Р < 0,001.		значимы соот-

Среди микроорганизмов, выявленных в содержимом толстого отде- ла кишечника поросят, часть относится к условно-патогенным и патоген- ным. Бактерии рода Fusobacterium, обнаруженные у поросят обеих групп, традиционно считались возбудителями некробактериоза скота (26), в настоящее время с использованием молекулярно-генетических методов подтверждено их присутствие в кишечнике, различных органах, на кожных покровах у животных и человека (27). Представители семейств Enterobacteri-aceae, Сampylobacteriaceae, выявленные в кишечнике в незначительных количествах, относятся к типичным возбудителям дисбиотических процессов у животных. Вызывает интерес то обстоятельство, что в кишечнике поросят были обнаружены бактерии из семейства Pasteurellaceae — возбудители заболеваний респираторного тракта у животных и птицы (16). В то же время бактерии рода Staphylococcus, традиционно присутствующие в содержимом кишечника животных, у поросят практически отсутствовали.

Часть микроорганизмов при таксономическом анализе бактериального сообщества идентифицировать не удалось, что согласуется с данными зарубежных и отечественных исследований микробиома пищеварительного тракта разных видов животных и птицы (23, 28). Что касается идентифицированных бактерий, то результаты, полученные с применением метода T-RFLP, тоже не противоречили известным представлениям (16, 21, 25) за некоторыми исключениями. Так, бактерии рода Lactobacillus , которые считаются доминирующими обитателями кишечника свиней, в исследованных нами пробах обнаруживались в небольших количествах. Кроме того, в кишечнике этих поросят полностью отсутствовали энтерококки и бифидобактерии, описанные ранее как представители автохтонной микробиоты толстого отдела кишечника у животных и птицы (16, 21).

Выпаивание один раз в неделю препарата на основе штамма L. plantarum L-211, продуцирующего в минимальной питательной среде в среднем 148,4±4,45 мг/л лизина (8, 9), в количестве не менее 10⁹ КОЕ/гол. качественно и количественно изменяло микробиоту толстого отдела кишечника поросят. Достоверно 3-кратно увеличивалась доля представителей рода Lactobacillus (Р < 0,01), что, вероятно, связано с хорошей приживаемостью и размножением интродуцированных лактобацилл в содержимом кишечника. Известна способность ряда лактобактерий к адгезии на стенках кишечника, что позволяет им колонизировать пищеварительный тракт (29) и занимать свободные экологические ниши в его микробиоме, оказывая пробиотический эффект. Кроме того, при выпаивании штамма L. plantrum L-211 более чем 3-кратно возросло число представителей рода Bacillus (Р < 0,01), которые тоже способны (благодаря синтезу органических кислот и бактериоцинов) к конкурентному вытеснению патогенов (16). Добавление препарата L. plantarum L-211 к рациону поросят также сказалось на размножении бактерий из филы Bacteroidetes и класса Clostridia , продуцирующих целлюлозо- и амилолитические ферменты, вызвав соответственно 5- (Р < 0,01) и 2-кратное (Р < 0,01) увеличение их числа в толстом кишечнике по сравнению с контролем. Доля бактерий из порядка Negativicutes , утилизирующих кислоты, под влиянием пробиотических лактобактерий существенно не менялась.

Важное значение имел положительный эффект от применения пробиотического препарата на основе L. plantarum L-211 в отношении условнопатогенных и патогенных бактерий, доля которых в кишечнике поросят из опытной группы уменьшалась. При этом представленность рода Staphylococcus и семейства Сampylobacteriaceae снижалась до количеств, не детектируемых методом T-RFLP, а семейства Pasteurellaceae — в 1,41 раза (Р < 0,05). Также достоверно сокращалась численности бактерий семейства Pseudomon-adaceae (в 4,57 раза, Р < 0,001) — транзитных микроорганизмов, поступающих в кишечник с кормом. Доля неидентифицированных бактерий до- стоверно снижалась в опыте относительно контроля (в 2,05 раза, Р < 0,01).

2. Зоотехнические показатели у 84-суточных поросят породы крупная белая при выпаивании препарата на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211 (ООО «Новгородский бекон», Новгородская обл.)

Показатель	I группа (контроль, n = 715)	II группа (опыт, n = 657)
Общая масса, кг Пад¸ж:	8567	6753
по числу, гол.	13	8
по массе, кг Санитарный забой:	203	116
по числу, гол.	9	11
по массе, кг Передано на откорм:	181	299
по числу, гол.	693	638
по массе, кг	21550	19875
Масса ( Х ± х ), кг/гол.	31,10±1,48	31,15±1,39
Сохранность, %	98,18	98,78
Валовый прирост, кг	13367	13537
Возраст при передаче, сут	83	84
Кормодней, всего Среднесуточный прирост	28675	27288
массы ( Х ± х ), г Расход комбикорма, кг:	466,20±11,29	496,10±10,14*
всего	26700	26400
комбикорм СК-4	17890	18300
комбикорм СК-5	8810	8100
Конверсия корма ( Х ± х ), кг Расход комбикормов	1,997±0,040	1,950±0,050
на кормодень, кг	0,931	0,967

П р и м еч а ни е. Описание групп см. в разделе «Методика». * Различия с контролем статистически значимы при Р < 0,05.

Анализ зоотехнических показателей (табл. 2) подтвердил повышение сохранности, среднесуточного прироста массы (Р < 0,05) и эффективности конверсии корма при использовании препарата L. plantarum L-211.

Итак, препарат на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211, синтезирующего лизин, обладает высокой пробиотической активностью, оказывая положительное воздействие на состав бактериального сообщества толстого кишечника поросят. При скармливании препарата доля представителей нормофлоры (роды Lactobacillus и Bacillus) достоверно увеличивалась, ряда микроорганизмов, традиционно связанных с дисбиозом кишечника у человека и животных (семейства Сampylobacteriaceae, Pasteurellaceae, род Staphylococ- cus) — уменьшалась. Изменение структуры микробного сообщества положи-

тельно отразилась на зоотехнических показателях: повысилась сохранность поросят, среднесуточный прирост массы (Р < 0,05), улучшилась конверсия корма. Следовательно, этот пробиотик в период доращивания может способствовать получению высокопродуктивного поголовья и снижению затрат комбикормов на единицу продукции.