Биоразнообразие и метаболические функции микробиома рубца у молочных коров в разные физиологические периоды

В условиях интенсификации скотоводства негативное влияние на микробиоту рубца и, как следствие, на физиологию крупного рогатого скота оказывает совокупность стресс-факторов, в частности экстремально высокая молочная продуктивность, несогласованность нейрогуморальной и гормональной регуляции потребления корма и синтеза молока, отрицательный энергетический баланс, использование кормов, содержащих избыточное количество крахмала. В представленной работе впервые показано, что физиологические периоды у молочного скота - это важный фактор, определяющий относительное изобилие неатрибутируемых бактерий из кандидатных семейств vadinBE97 и WCHB1-41, функции которых практически не изучены. Наиболее выраженные изменения метаболического потенциала микробиоты, а именно угнетение различных типов обмена веществ в химусе рубца, в частности энергетического (цикл трикарбоновых кислот), белкового, углеводного, липидного, включая синтез летучих жирных кислот (ЛЖК), наблюдаются у коров в период стабилизации и спада лактации по сравнению с сухостойными, новотельными и раздойными животными. Цель работы - изучение состава и метаболического потенциала микробиома рубца у коров молочного направления в различные физиологические периоды. Эксперимент проводили летом 2020 года в АО «Агрофирма Дмитрова Гора» (Тверская обл.) на 15 коровах (Bos taurus) молочного направления черно-пестрой голштинизированной породы 2-3-й лактации. Животные были разделены на пять групп (по n = 3): I группа - сухостойные (в среднем за 30 сут до отела), II - новотельные (среднее число дней доения - 20), III - в период раздоя (среднее число дней доения - 90), IV - в период стабилизации лактации (208-е сут лактации), V - в период спада лактации (310-е сут лактации). Рационы коров рассчитывали в программе AMTS.Cattle.Professional в соответствии с общепринятыми требованиями. Тотальную ДНК из образцов химуса рубца выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва). Оценку бактериального сообщества рубца проводили методом NGS-секвенирования на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с применением праймеров для V3-V4 региона 16S рРНК. Секвенирование осуществляли с использованием реагентов для подготовки библиотек Nextera® XT IndexKit («Illumina, Inc.», США), для очистки ПЦР продуктов Agencourt AMPure XP («Beckman Coulter, Inc.», США) и для проведения секвенирования MiSeq® ReagentKit v2 (500 cycle) («Illumina, Inc.», США). Биоинформатический анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения Qiime2 ver. 2020.8. Фильтрацию шумовых последовательностей проводили методом Deblur. Для построения филогении de novo применяли программный пакет MAFFT. Для анализа таксономии использовали справочную базу данных Silva 138 (https://www.arb-silva.de/documentation/release-138/). Реконструкцию и прогнозирование функционального содержания метагенома осуществляли при помощи программного комплекса PICRUSt2 (v.2.3.0). Для анализа метаболических путей и ферментов пользовались базой данных MetaCyc. Тотальную РНК из образцов рубцового содержимого выделяли с помощью набора Aurum Total RNA («Bio-Rad», США). На матрице РНК получали кДНК (набор iScript RT Supermix, «Bio-Rad», США). Относительную экспрессию генов Ldh-L и Ldb 0813 бактерий определяли в количественной ПЦР. Реакцию амплификации с праймерами гена Ldb 0813 , связанного с синтезом D-лактатдегидрогеназы, и L-лактатдегидрогеназы (ген Ldh-L ) проводили при помощи набора SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix («Bio-Rad», США). В результате 16S метагеномного секвенирования содержимого рубца показано снижение α-разнообразия бактериальной микробиоты у коров из IV и V групп (р ≤ 0,05). Обнаружены 12 суперфилумов и филумов микроорганизмов. Суперфилум Bacteroidota и филум Firmicutes были определены как «доминантные» бактерии рубца (соответственно до 59,94±1,86 и 46,82±14,40 % сообщества). Бактерии суперфилума Actinobacteriota полностью элиминировались из рубца лактирующих коров, присутствуя только в рубце сухостойных животных. Бактерии суперфилума Armatimonadota исчезали из рубца новотельных коров и животных в период стабилизации лактации, филума Chloroflexi - в периоды раздоя и стабилизации лактации. Выявлены существенные различия между животными по 8 бактериальным семействам, в том числе Muribaculaceae , Prevotellaceae , Erysipelatoclostridiaceae , Oscil-lospiraceae , Ruminococcaceae , Saccharimonadaceae , кандидантым семействам WCHB1-41, vadinBE97. Обнаружено появление в составе микробиома коров в новотельный период и персистирование в последующие периоды лактации родов Asteroleplasma , Sharpea , Moryella , Oribacterium , Shuttleworthia . Эти бактерии отсутствовали в составе микробиома рубца в период сухостоя. Предсказанный функциональный потенциал 17 метаболических путей микробиома различался (р ≤ 0,01) у коров из разных опытных групп.