Генетика и геномика. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Анализ полиморфизма гена дисферлина у генофондных пород кур
Статья научная
Дисферлин относится к белкам, участвующим в репарации мышечной мембраны. Предполагается, что некоторые мононуклеотидные замены в гене дисферлина ( DYSF ) связаны с формированием мышечной массы у домашней птицы. В настоящей работе впервые у кур породы русская белая выявлены четыре мононуклеотидные замены, находящиеся в 32-м интроне на 4-й хромосоме, - rs317801013 (G/A) в позиции 90672849, rs16455118 (С/A) в позиции 90672756, rs318045896 (A/G) в позиции 90672862, T/G в позиции 90672805. Мононуклеотидный полиморфизм T/G на 4-й хромосоме в позиции 90672805 представлен для регистрации в базу данных ENSEMBL, поскольку у вида Gallus gallus был выявлен впервые. Также впервые проведен анализ частоты встречаемости генотипов и отклонения наблюдаемого распределения генотипов от ожидаемого при равновесии Харди-Вайнберга у генофондных кур породы русская белая по всем вышеуказанным заменам в гене дисферлина. Целью работы было изучение мононуклеотидных полиморфизмов (SNPs) гена дисферлина у генофондных пород кур и выявление возможных ассоциаций полиморфизмов гена DYSF с хозяйственно ценными характеристиками. Материалом для исследования служили куры мясного (корниш), яичного направления (русская белая, род-айланд, аврора, австролорп черно-пестрый, ленинградская ситцевая) и декоративные породы (русская хохлатая, брама светлая, голошейная) из генофондной популяции Генетической коллекции редких и исчезающих пород кур (ВНИИГРЖ, г. Санкт-Петербург-Пушкин). ДНК выделяли фенольным методом из крови, взятой из подкрыльцовой вены. Для анализа полиморфизма rs16455118 пользовались базой данных, полученной в результате генотипирования с применением чиповой технологии Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip («Illumina, Inc.», США). Проанализирована частота встречаемости генотипов АА , АС , СС и отклонения наблюдаемого распределения генотипов от ожидаемого при равновесии Харди-Вайнберга у генофондных кур по замене аденина на цитозин в гене дисферлина (rs16455118). Достоверность полученных данных оценивали с применением критерия χ2 Пирсона. Полиморфизм гена дисферлина анализировали методом секвенирования участка гена DYSF размером 237 п.н. на 4-й хромосоме у 76 кур породы русская белая. Провели анализ международных баз генетических данных NCBI и ENSEMBL для идентификации выявленных замен. По четырем обнаруженным заменам проведен анализ частоты генотипов и аллелей. В результате генотипирования 185 кур с использованием чиповой технологии Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip был выявлен мононуклеотидный полиморфизм rs16455118. Наблюдали смещение частоты встречаемости аллелей в сторону увеличения гетерозиготных генотипов АС у кур декоративного направления, генотип АА присутствовал в меньшинстве. У кур яичного направления наибольшую частоту встречаемости имел гомозиготный генотип АА , генотип СС был малочисленным, а у популяции кур породы аврора полностью отсутствовал. Мясная порода корниш имела более равномерное распределение генотипов в сравнении с декоративными и яичными. Мы секвенировали участок гена дисферлина размером 237 п.н., расположенный на 4-й хромосоме у кур породы русская белая, и обнаружили четыре мононуклеотидные замены, находящиеся в 32-м интроне. Мононуклеодидные замены G/A (rs317801013), С/А (rs16455118), A/G (rs318045896) соответствовали заменам в геноме кур, зарегистрированным в международных генетических базах данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) и ENSEMBL (https://www.ensembl.org/index.html). Мононуклеотидный полиморфизм T/G в позиции 90672805 выявлен впервые. Сдвиг генетического равновесия, который наблюдался у генофондных кур породы русская белая, свидетельствует об эффекте основателя либо селекционном давлении на район мононуклеотидной замены rs16455118. Практически полное отсутствие гетерозигот у яичных пород кур может указывать на инбридинг или сильное селекционное давление. Полученные результаты в дальнейшем могут быть использованы для поиска ассоциаций с показателями продуктивности у кур для создания системы молекулярно-генетических маркеров, что позволит ускорить селекционный прогресс.
Бесплатно
Статья научная
В условиях интенсификации скотоводства негативное влияние на микробиоту рубца и, как следствие, на физиологию крупного рогатого скота оказывает совокупность стресс-факторов, в частности экстремально высокая молочная продуктивность, несогласованность нейрогуморальной и гормональной регуляции потребления корма и синтеза молока, отрицательный энергетический баланс, использование кормов, содержащих избыточное количество крахмала. В представленной работе впервые показано, что физиологические периоды у молочного скота - это важный фактор, определяющий относительное изобилие неатрибутируемых бактерий из кандидатных семейств vadinBE97 и WCHB1-41, функции которых практически не изучены. Наиболее выраженные изменения метаболического потенциала микробиоты, а именно угнетение различных типов обмена веществ в химусе рубца, в частности энергетического (цикл трикарбоновых кислот), белкового, углеводного, липидного, включая синтез летучих жирных кислот (ЛЖК), наблюдаются у коров в период стабилизации и спада лактации по сравнению с сухостойными, новотельными и раздойными животными. Цель работы - изучение состава и метаболического потенциала микробиома рубца у коров молочного направления в различные физиологические периоды. Эксперимент проводили летом 2020 года в АО «Агрофирма Дмитрова Гора» (Тверская обл.) на 15 коровах (Bos taurus) молочного направления черно-пестрой голштинизированной породы 2-3-й лактации. Животные были разделены на пять групп (по n = 3): I группа - сухостойные (в среднем за 30 сут до отела), II - новотельные (среднее число дней доения - 20), III - в период раздоя (среднее число дней доения - 90), IV - в период стабилизации лактации (208-е сут лактации), V - в период спада лактации (310-е сут лактации). Рационы коров рассчитывали в программе AMTS.Cattle.Professional в соответствии с общепринятыми требованиями. Тотальную ДНК из образцов химуса рубца выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва). Оценку бактериального сообщества рубца проводили методом NGS-секвенирования на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с применением праймеров для V3-V4 региона 16S рРНК. Секвенирование осуществляли с использованием реагентов для подготовки библиотек Nextera® XT IndexKit («Illumina, Inc.», США), для очистки ПЦР продуктов Agencourt AMPure XP («Beckman Coulter, Inc.», США) и для проведения секвенирования MiSeq® ReagentKit v2 (500 cycle) («Illumina, Inc.», США). Биоинформатический анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения Qiime2 ver. 2020.8. Фильтрацию шумовых последовательностей проводили методом Deblur. Для построения филогении de novo применяли программный пакет MAFFT. Для анализа таксономии использовали справочную базу данных Silva 138 (https://www.arb-silva.de/documentation/release-138/). Реконструкцию и прогнозирование функционального содержания метагенома осуществляли при помощи программного комплекса PICRUSt2 (v.2.3.0). Для анализа метаболических путей и ферментов пользовались базой данных MetaCyc. Тотальную РНК из образцов рубцового содержимого выделяли с помощью набора Aurum Total RNA («Bio-Rad», США). На матрице РНК получали кДНК (набор iScript RT Supermix, «Bio-Rad», США). Относительную экспрессию генов Ldh-L и Ldb 0813 бактерий определяли в количественной ПЦР. Реакцию амплификации с праймерами гена Ldb 0813 , связанного с синтезом D-лактатдегидрогеназы, и L-лактатдегидрогеназы (ген Ldh-L ) проводили при помощи набора SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix («Bio-Rad», США). В результате 16S метагеномного секвенирования содержимого рубца показано снижение α-разнообразия бактериальной микробиоты у коров из IV и V групп (р ≤ 0,05). Обнаружены 12 суперфилумов и филумов микроорганизмов. Суперфилум Bacteroidota и филум Firmicutes были определены как «доминантные» бактерии рубца (соответственно до 59,94±1,86 и 46,82±14,40 % сообщества). Бактерии суперфилума Actinobacteriota полностью элиминировались из рубца лактирующих коров, присутствуя только в рубце сухостойных животных. Бактерии суперфилума Armatimonadota исчезали из рубца новотельных коров и животных в период стабилизации лактации, филума Chloroflexi - в периоды раздоя и стабилизации лактации. Выявлены существенные различия между животными по 8 бактериальным семействам, в том числе Muribaculaceae , Prevotellaceae , Erysipelatoclostridiaceae , Oscil-lospiraceae , Ruminococcaceae , Saccharimonadaceae , кандидантым семействам WCHB1-41, vadinBE97. Обнаружено появление в составе микробиома коров в новотельный период и персистирование в последующие периоды лактации родов Asteroleplasma , Sharpea , Moryella , Oribacterium , Shuttleworthia . Эти бактерии отсутствовали в составе микробиома рубца в период сухостоя. Предсказанный функциональный потенциал 17 метаболических путей микробиома различался (р ≤ 0,01) у коров из разных опытных групп.
Бесплатно
Генетическая дифференциация индеек разных пород по микросателлитным маркерам
Статья научная
Ению важная роль отводится изучению генетических особенностей, в том числе с использованием микросателлитных локусов. При реализации международного проекта по изучению генетического биоразнообразия домашних животных (Global Project for the Measurement of Domestic Animal Genetic Diversity, MoDAD) по микросателлитным маркерам было исследовано 50 популяций разных видов птицы. Изучение биоразнообразия индеек на первоначальном этапе проводилось с использованием микросателлитных локусов курицы ( Gallus gallus ), затем были установлены информативные локусы для генома индеек ( Meleagris gallopavo ). Накоплены данные о генетических профилях, сходстве, различии и межпородной дифференциации пород индеек, разводимых в США, Италии, Венгрии и других странах. В настоящей работе впервые установлено генетическое взаимоотношение между породами индеек российской селекции и генофондной популяции университета Миннесоты на основе микросателлитных маркеров. Показано, что величина генетических дистанций между породами во многом определяется их происхождением, ареалом разведения, а также вкладом генофонда одних пород при создании и совершенствовании продуктивных качеств других. Цель работы - изучить генетическое разнообразие и межпородную дифференциацию индеек российской и зарубежной селекции с использованием микросателлитных локусов. Работа выполнялась на Северо-Кавказской зональной опытной станции по птицеводству в 2019 году. У 30 особей каждой из семи пород индеек ( Meleagris gallopavo ) отечественной селекции (белой широкогрудой, BSH; бронзовой северокавказской, BrSK; белой северокавказской, BeSK; серебристой северокавказской, SSK; московской белой, MB; черной тихорецкой, CHT; узбекской палевой, UP) были отобраны образцы крови. ДНК выделяли в соответствии с протоколом к коммерческому набору АмплиПрайм ДНК-сорб-В («ИнтерЛабСервис», Россия). Количество и качество выделенной ДНК контролировали с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000 («Thermo Scientific», США) стандартным спектрофотометрическим методом. Генотипирование проводили по 12 микросателлитным локусам MNT9-MNT20. Для сравнения с генотипами индеек отечественных пород использовали описанные генотипы индеек (AM) генофондной фермы университета Миннесоты (Nicholas Turkey Breeding Farms). Вычисляли среднее число и число эффективных аллелей на локус (Na, Ne), степень наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (Но, Не), индекс Шеннона (I). Генетическую структуру популяций оценивали на основании значений Fst и генетических дистанций по M. Nei. Для построения филогенетического дерева применяли метод ближайшего соседа (Neighbor Joining Method). Российские породы индеек и популяция АМ характеризовались низким генетическим разнообразием. Число выявленных аллелей в локусах микросаттеллитов в целом по породной выборке варьировало от 1 до 4, число аллелей на один локус колебалось от 1,0 до 1,83. Наименьшее генетическое различие установлено между породами MB и BSH. Породы BeSK, SSK и BrSK сформировали отдельный узел, при этом наибольшее генетическое удаление проявляла BrSK, образуя наибольшую по генетическому расстоянию ветвь. В отдельные ветви на относительно равном удалении выделились породы CHT, UP и популяция АМ. Таким образом, получено подтверждение, что генофонд исследованных пород и популяций домашних индеек характеризуется незначительным генетическим разнообразием по сравнению с генофондом других видов сельскохозяйственных животных.
Бесплатно
Статья научная
Интенсивность отложения жира, в том числе абдоминального, - один из важных показателей, характеризующих как мясную продуктивность и качество продукции, так и общее здоровье сельскохозяйственной птицы. Этот признак положительно коррелирует с быстрым ростом птицы и в значительной степени зависит не только от условий кормления и содержания, но и от генетических факторов. В основном данные о генетических механизмах, обусловливающих жировой обмен и интенсивность отложения жира, получены на курах, идентифицированы SNPs и гены-кандидаты, детерминирующие отложение как внутримышечного, так и брюшного (абдоминального) жира. Число подобных исследований на перепелах относительно невелико. К настоящему времени в специальной литературе недостаточно информации о локусах количественных признаков (QTL), достоверно связанных с показателями жирового обмена у перепелов. В представленной работе впервые сообщается о выявленных SNPs, с высокой достоверностью (p 2 модельной ресурсной популяции. В области выявленных SNPs установлены гены-кандидаты, достоверно связанные с этим признаком. Целью работы были поиск SNPs и идентификация генов-кандидатов, связанных с отложением абдоминального жира у перепелов. Исследования проводили на самцах F2 модельной ресурсной популяции ( n = 146), полученной при скрещивании двух контрастных по скорости роста и мясным качествам пород - японских (медленный рост) и техасских (быстрый рост) перепелов. Особей F2 генотипировали методом GBS (genotyping-by-sequencing, генотипирование посредством секвенирования). Для выявления ассоциаций между данными полногеномного генотипирования и количеством абдоминального жира использовали программное обеспечение PLINK 1.9 с принятыми ограничениями (geno 0,1; mind 0,1; maf 0,05). В качестве порогового критерия достоверности установили p 2 ресурсная популяция перепелов характеризовалась высокой вариабельностью по содержанию абдоминального жира в туше. В возрасте 56 сут этот показатель варьировал от 0,01 до 10,46 г и составил в среднем 2,41±0,16 г. На основании проведенного GWAS-анализа (genome-wide association study) идентифицировали 29 SNPs и 11 генов-кандидатов, находящихся в областях расположения этих SNPs, которые ассоциированы с отложением абдоминального жира у перепелов. Обнаруженные SNPs локализуются на хромосомах 1, 2, 7, 8, 17, 19, 21, 24 и 28. Установленные гены-кандидаты ( CNTN5, GNAL, PDE1A, RBMS1, PTPRF, SH3GLB2, SLC27A4, TRIM62, IGSF9B, USHBP1, NR2F6 ) идентифицированы на хромосомах CJA1 (1), CJA2 (1), CJA7 (2), CJA8 (1), CJA17 (2), CJA21 (1), CJA24 (1) и CJA28 (2). Детектированные SNP и гены-кандидаты могут послужить генетическими маркерами в программах селекции на улучшение мясных качеств перепелов и снижение содержания жира в тушках.
Бесплатно
Статья научная
Сохранение окружающей среды при интенсификации сельскохозяйственного и промышленного производства связывают с развитием экотехнологий, в том числе с биоконтролем патогенов растений и биоремедиацией. Микроорганизмы - продуценты биопрепаратов и деструкторы углеводородов характеризуются высокой спонтанной вариабельностью, что может приводить к изменению их активности, поэтому при стабилизирующем отборе необходимо периодически подтверждать их штаммовую принадлежность. Молекулярно-генетические методы исследований дают возможность идентифицировать возбудителей заболеваний c полной характеристикой их наследственного материала. В этой работе представлены данные о применении разработанного нами метода двойного расщепления и избирательного мечения (ДРИМ) для изучения генетических профилей бактерий-фитопатогенов родов Pseudomonas , Pectobacterium и их антагонистов Bacillus subtilis ( Bs ), подтверждена высокая биологическая эффективность двух отселектированных штаммов Bs (М-22 и И5-12/23) против бактериальных болезней картофеля при хранении клубней в производственных условиях. Также впервые выполнена генетическая идентификация (паспортизация) штаммов бактерий-деструкторов рода Pseudomonas , пригодных для решения природоохранных задач. Цель исследований заключалась в оценке генетического разнообразия бактерий нескольких родов для отбора наиболее эффективных штаммов-антагонистов и штаммов-деструкторов. Примененный нами метод генотипирования основан на использовании двух эндонуклеаз рестрикции для расщепления геномной ДНК бактерии. Присутствующая в реакционной смеси ДНК-полимераза (Taq) обеспечивает мечение фрагментов ДНК биотинилированным дезоксицитозинтрифосфатом (Bio-dCTP). Метка включается только в ДНК, имеющую 3¢-усеченные концы, которые образует первый ферментом. Вторая эндонуклеаза рестрикции дает только тупые концы фрагментов, которые не способны присоединять метку. В результате переноса на фильтр визуализируются 20-50 четко различимых фрагментов ДНК, число и распределение которых характерно для каждого бактериального штамма. Генотипирование двух близкородственных штаммов Pectobacterium atrosepticum позволяет распознать около 50 фрагментов ДНК, более 20 % которых специфичны для одного из сравниваемых штаммов. Мы использовали две пары эндонуклеаз рестрикции - XbaI/DraI и XbaI/Eco24I; полученные результаты указывают на одинаковую дискриминационную способность ферментов при сопоставлении штаммов P. atrosepticum Д822 и Г784 по генетическим профилям. При генотипировании бактерий рода Pseudomonas оптимальной была пара BcuI/Eco32I, для Bs первая рестриктаза - SgsI (39 сайтов расщепления), вторая (уменьшает размер получаемых фрагментов ДНК) - Eco32I. Методом ДРИМ получены генетические профили микроорганизмов родов Pectobacterium и Pseudomonas , характеризующие индивидуальность каждого штамма. Отмечены существенные генетические различия между видами Ps. fluorescens и Ps. marginalis . При этом выявлены идентичные фрагменты ДНК, что указывает на родовую филогенетическую близость этих видов. При искусственном заражении клубней установлена высокая антагонистическая активность Bs И5-12/23 в отношении штаммов P. atrosepticum и P. сarotovorum subsp. catovorum. Подтверждена высокая биологическая эффективность двух отселектированных штаммов Bs (М-22 и И5-12/23) против бактериальных болезней картофеля при хранении клубней. Штамм Bs И5-12/23 обладал более выраженной антагонистической активностью против возбудителей мягкой бактериальной и кольцевой гнилей, а также фузариоза. При хранении обработка штаммами-антагонистами снижала пораженность почти вдвое по сравнению с контролем (30,4-35,5 % здоровых клубней против 13,3 %). По результатам генотипирования биодеструкторов рода Pseudomonas сформирована коллекция штаммов, утилизирующих трудноокисляемые соединения, включая тяжелые фракции нефти и полиароматические углеводороды (бензопирен, хризен, фенантрен, антрацен, хризен, нафталин), что позволяет составлять ассоциации штаммов-деструкторов для утилизации конкретных загрязнителей. Таким образом, ДРИМ-генотипирование позволяет идентифицировать бактериальные штаммы для подтверждения их происхождения при разработке и применении биопрепаратов различного назначения.
Бесплатно
Статья научная
Анализ ДНК древних и исторических образцов, в том числе экземпляров из музейных и краниологических коллекций, неоценим как способ получения генетической информации для реконструкции происхождения локальных пород животных. Принимая во внимание высокую степень деградации ДНК в большинстве таких образцов, исследования проводят, как правило, на митохондриальном геноме, поскольку он присутствует в сотнях или даже тысячах копий в одной клетке. Однако в некоторых случаях исследование митохондриальной ДНК (мтДНК) не позволяет в полной мере проследить демографическую историю видов и пород, особенно при вовлечении в скрещивания производителей, представляющих улучшающие породы. Информативным инструментом для анализа такого рода демографических событий служат микросателлиты, или короткие тандемные повторы (STR). Однако генотипирование микросателлитов при использовании ДНК, выделенной из музейных образцов, сопряжено с повышенным риском ошибок амплификации. Цель нашей работы - усовершенствование алгоритма определения консенсусных генотипов STR-маркеров для проб, содержащих сильно деградированную ДНК, и оценка его эффективности на музейных образцах костной ткани крупного рогатого скота. Материалом для исследования служили музейные экспонаты черепов крупного рогатого скота, датированные концом XIX-первой половиной XX века, хранящиеся в краниологической коллекции Музея животноводства им. Е.Ф. Лискуна (РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева, г. Москва). Образцы генотипировали с помощью мультиплексной панели, включавшей 11 микросателлитных локусов, рекомендованных Международным обществом генетики животных (ISAG), по протоколам, принятым в ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста. Успешность амплификации для каждого локуса в образце оценивали на основании расчета индексов качества генотипирования (quality indices, QI). Наиболее часто встречающийся генотип кодировали как 1, а отличающиеся от него за счет выпадения аллелей (allelic drop-out, ADO) или ложных аллелей (false alleles, FA) генотипы - как 0. Далее рассчитывали долю генотипов со значением 1 по отношению к общему числу повторов. Пороговое значение для QI было установлено на уровне 0,75. В консенсусный генотип включали генотипы, показавшие частоту встречаемости выше порогового значения для каждого локуса. Тестирование алгоритма выполнено на 144 музейных образцах черно-пестрого, турано-монгольского, палево-пестрого и бурого крупного рогатого скота. Полный профиль (11 микросателлитных локусов) удалось получить для 60,42 % случаев. Качество генотипирования в большинстве локусов (9 из 11 исследованных) было выше 0,950, варьируя от 0,951±0,011 в локусе TGLA122 до 0,995±0,003 в локусе BM2113. По результативности наименее успешным оказалось генотипирование локусов TGLA53 и BM1818 (соответственно 74,86 % и 61,45 %). Выявлена положительная корреляция на уровне тенденции ( r 2 = 0,53; p = 0.09) между размером аллелей в локусе и долей ошибок генотипирования. Поскольку изучение аллелофонда популяций невозможно без получения корректных генотипов, предложенный нами алгоритм, обеспечивающий вероятность корректного генотипирования p function show_abstract() { $('#abstract1').hide(); $('#abstract2').show(); $('#abstract_expand').hide(); }
Бесплатно
Статья научная
Фитофтороз, вызываемый оомицетом Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, - одно из самых вредоносных заболеваний томатов. Наиболее перспективным методом борьбы с ним остается выведение устойчивых сортов, при создании которых широко используется интрогрессия генов устойчивости из дикорастущих родственных видов. В частности, несколько генов устойчивости к фитофторозу, идентифицированных у дикого вида томата Solanum pimpinellifolium , были интрогрессированы в культурные сорта. Наиболее сильным геном считается Ph-3 , поскольку он обеспечивает устойчивость к множеству изолятов P. infestans . На сегодняшний день известны ДНК-маркеры, так или иначе ассоциированные с этим геном. Однако в геноме томата были обнаружены гомологи этого гена, которые не обладают функциональной активностью. В настоящей работе впервые показано, что в сортах томата отечественной селекции при наличии гена Ph-3 отсутствуют другие его гомологи. Также впервые установлено, что в последовательности гена Ph-3 присутствует вставка ретротранспозона, которая может приводить к потере геном своей функциональной активности. Нашей целью было создание простого в использовании высокоспецифичного ДНК-маркера гена Ph-3 , с помощью которого можно отличить Ph-3 от его структурных гомологов, и валидация этого маркера в сравнении с уже известными маркерами на основе анализа коллекции отечественных сортов и линий томата и оценки связи маркеров с полевой устойчивостью к фитофторозу. В работе использовали 24 образца томата ( Solanum lycopersicum L.). Исследования проводили в 2021 году на опытном поле ФГБНУ ФНЦО (Московская обл., Одинцовский р-н). Рассаду высаживали в грунт в I декаде июня. Поражение фитофторозом учитывали в динамике через каждые 7 сут, начиная с появления первых симптомов (III декада июля). Тотальную ДНК выделяли из молодых листьев 2-недельных растений при помощи набора реагентов Сорб-ГМО-Б («Синтол», Россия). Дизайн праймеров для специфичной амплификации гена Ph-3 осуществляли на основе множественного выравнивания нуклеотидной последовательности гена Ph-3 (GenBank no. KJ563933) и его структурных гомологов SlRGA1 , SlRGA2 , SlRGA 3 и SlRGA4 . Были подобраны праймеры, амплифицирующие фрагмент гена Ph-3 размером 412 п.н.: прямой 5'-AATATTGAAAATAGCTGCACTGA-3' и обратный 5'-CGAGATTTGGAGGGAATGTAA-3'. Созданный маркер получил название Ph3-412. Кроме того, для сравнительного анализа использовали праймеры маркера NC-LB-9-6678, амплифицирующие фрагменты размером 601 и 907 п.н.: 5'-CCTTAATGCAATAGGCAAAT-3' и 5'-ATTT-GAATGTTCTGGATTGG-3', последовательности которых абсолютно консервативны для гена Ph-3 и его гомологов. Для определения нуклеотидных последовательностей полученных ампликонов их клонировали в вектор pAL-TA («Евроген», Россия), которым трансформировали компетентные клетки Escherichia coli DH5a, и секвенировали по методу Сэнгера. Осуществляли множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей с последующим анализом результатов выравнивания. Для построения дендрограммы использовали программу TREECON (http://bioinfor-matics.psb.ugent.be/software/details/Treecon). Производные аминокислотные последовательности были получены с помощью программы EditSeq (https://macdownload.informer.com/editseq/down-load/). Для поиска гомологов полученных последовательностей в базе данных NCBI использовали программу BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). При сравнении результатов молекулярного анализа с данными фенотипической оценки полевой устойчивости к фитофторозу ни один из маркеров не показал однозначной связи с полевой устойчивостью. Мы подтвердили, что амплифицируемый с помощью праймеров Ph3-412 фрагмент принадлежит гену Ph-3 , в то время как фрагмент размером 601 п.н., который получают с праймерами NC-LB-9-6678, соответствует гомологу SlRGA4. Показано, что фрагмент размером 907 п.н., полученный с теми же праймерами, гомологичен гену Ph-3 , но при этом содержит вставку LTR ретротранспозона семейства Ty1- copia размером 306 п.н. У всех сортов, у которых был обнаружен ген Ph-3 , он содержал вышеуказанную вставку. Наличие такой вставки может приводить к потере функциональной активности, что необходимо учитывать при маркировании гена Ph-3 . Исходя из этого, набольшую селекционную ценность представляют генотипы, у которых ген Ph-3 не имеет вставки ретротранспозона.
Бесплатно
Статья научная
Кукуруза ( Zea mays L.) - важная сельскохозяйственная культура, одним из ценных признаков которой считается биосинтез предшественников витамина А в зерне и фотосинтезирующей ткани. Количество провитамина А в зерне находится в зависимости от экспрессии гена ликопин-ε-циклазы LcyE , катализирующей образование α-каротина и участвующей в регуляции соотношения ветвей b-b и b-e пути метаболизма каротиноидов. В настоящей работе впервые выявлено отсутствие ассоциаций между окраской зерна и содержанием суммы каротиноидов и β-каротина в листьях кукурузы, установлено наличие положительной связи между количеством β-каротина и хлорофиллов a и b, определена обратная зависимость между содержанием β-каротина и хлорофиллов a и b и уровнем экспрессии гена LycE . Целью работы был анализ корреляционной связи содержания суммы каротиноидов, β-каротина и хлорофиллов а и b с экспрессией гена LcyE в листьях инбредных линий кукурузы отечественной селекции. В работе использовали четыре инбредные линии кукурузы: три белозерные (6097-1, МБК, Тетраплоид Шумного) и одну (5580-1) с желтой окраской зерна. Зерна проращивали в увлажненной почве при 23/25 °С и режиме 16/8 ч (день/ночь) до появления 4-го настоящего листа. Суммарную РНК выделяли из 50-100 мг ткани листьев и использовали для синтеза кДНК (GoScriptтм Reverse Transcription System, «Promega», США). Экспрессию гена LcyE в листьях определяли методом количественной ПЦР в реальном времени с нормализацией данных по референсному гену Zea mays polyubiquitin (NM_001329666.1; праймеры ZmUBI-rtF: 5´-ATCGTGGTTGTGGCTTCGTTG-3´, ZmUBI-rtR: 5´-GCTGCAGAAGAGTTTTGG-GTACA-3´). Для реакции использовали 3 нг кДНК-матрицы, кДНК-специфичные праймеры (ZmLcyE-F: 5´-TTTACGTGCAAATGCAGTCAA-3´, ZmLcyE-R: 5´-TGACTCTGAAGCTAGAGAAAG-3´), набор Реакционная смесь для проведения РВ-ПЦР в присутствии SYBR GreenI и ROX (ООО «Синтол», Россия) и термоциклер CFX96 Real-Time PCR Detection System («Bio-Rad Laboratories», США). Проводили количественное определение содержания суммы каротиноидов, хлорофиллов а и b и β-каротина в листьях. Растительную ткань (0,2 г) гомогенизировали в растворе Фолча (хлороформ:метанол, 2:1 v/v) в присутствии следовых количеств Mg2CO3, инкубировали 1 ч при 4 °С в водяной бане со льдом и центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин и 4 °С (центрифуга Eppendorf 5418 R, «Eppendorf», Германия). Собирали хлороформную фазу и измеряли содержание ликопина, β-каротина, суммы каротиноидов, хлорофиллов а и b. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах Eppendorf BioSpectrometer® basic («Eppendorf», Германия) и Cary 50 («Agilent Technology», США). Количество пигментов рассчитывали по соответствующим формулам. Корреляции между содержанием пигментов и экспрессией гена LcyE оценивали с помощью статистических методов. Самое высокое содержание каротиноидов было выявлено в листьях линии Тетраплоид Шумного. Образцы остальных трех линий синтезировали меньшее количество каротиноидов и были сходны между собой по этому параметру. В листьях линии 6097-1 было обнаружено приблизительно в 2 раза больше β-каротина и хлорофиллов a и b, чем у других анализируемых линий, несущественно различающихся между собой по количеству пигментов. Поскольку β-каротин служит предшественником ксантофиллов основного ксантофиллового цикла фотозащиты растений, можно говорить о повышенной скорости фотосинтеза в фотосинтезирующих тканях линии 6097-1 в сравнении с другими анализируемыми линиями. Соответственно, линия 6097-1 может обладать повышенной устойчивостью к оксидативному стрессу, а также служить донором признака повышенного содержания провитамина А (как силосная культура). Также установлено, что в листьях линий 5580-1 и Тетраплоид Шумного экспрессия гена LycE в ~ 4-5 раз выше, чем у линий МБК и 6097-1. Корреляционный анализ показал обратную зависимость между содержанием β-каротина и хлорофиллов a и b и уровнем экспрессии гена LycE . На основании полученных результатов мы предполагаем, что данные экспрессии гена LycE могут быть использованы в качестве экспрессионного молекулярного маркера количества провитамина А, синтезируемого в листьях кукурузы, а также при оценке степени устойчивости растения к фотоокислительному стрессу.
Бесплатно
Полиморфизм в генах-кандидатах, связанных с репродуктивными функциями у овец (Ovis spp.)
Статья научная
Репродуктивные качества значительно влияют на себестоимость овцеводческой продукции. Главные гены-кандидаты репродуктивных качеств овец - BMP15, GDF9 и BMPR1B , мутации в которых повышают число яйцеклеток при овуляции и число ягнят на ягнение. Периодически сообщается о сегрегации новых мутаций в расширяющемся породном спектре. Поэтому поиск новых SNPs в ранее не исследованных породах актуален для углубления знаний о генетических механизмах, лежащих в основе плодовитости овец. В нашей работе впервые проведен сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей генов GDF9, BMP15 и BMP15B у овец романовской породы, других пород домашних овец ( Ovis aries L.) и диких родственных видов. Идентифицированы SNPs, наиболее сильно различающиеся при сопоставлении романовской породы с автохтонными породами домашних овец России и Персидского Нагорья, а также диких видов рода Ovis . Впервые изучен полиморфизм в главных генах-кандидатах пролиферативных признаков у архара ( O. ammon L.) и муфлона ( O. orientalis L.). Выявлены SNPs, фиксированные у архара и домашней овцы. Исследования проводили в 2022-2023 годах в ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Анализировали последовательности полных геномов домашних овец - романовской ( n = 9), других российских ( n = 7) и иранских ( n = 6) пород, диких видов рода Ovis - азиатских муфлонов ( O. orientalis , n = 16) и архаров ( O. ammon , n = 4). Выравнивание на референсный геном выполнялось с помощью инструментов bwa-mem2 и SAMtools. Из полных геномов извлечены последовательности генов GDF9 , BMP15 и BMP15B , в которых на основе расчета значений FST для каждого SNP для каждой пары групп проведен поиск наиболее различающихся SNPs. При сравнении последовательностей генов у романовских овец и других пород наибольшие различия были обнаружены в гене BMPR1B (FST = 0,562-0,749) в отличие от генов BMP15 (FST = 0,051-0,374) и GDF9 (FST = 0,037-0,660). Сравнение последовательностей генов у романовских овец и архара выявило наличие фиксированных SNPs (FST = 1), при этом в гене GDF9 был идентифицирован один такой SNP. Наибольшие значения FST при сравнении овец романовской породы с муфлоном составили 0,702-0,780 (ген BMPR1B ) , 0,113-0,645 (ген BMP15 ) и 0,338-0,512 (ген GDF9 ). Таким образом, мы идентифицировали целевые SNPs и планируем продолжить изучение их влияния на репродуктивные признаки у романовских овец в следующих работах.
Бесплатно
Статья научная
Одним из наиболее важных признаков качества мяса служит его цветовая характеристика, которая во многом определяет потребительский спрос. Качество мяса оценивают по его цветовому спектру по специальным шкалам. В частности, широко применяется шкала L*a*b*, эффективность которой показана во многих отраслях мясного животноводства. В ряде исследований установлена генетическая обусловленность цветовых характеристик мяса сельскохозяйственных животных и птицы. Выявлены однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) и гены-кандидаты, детерминирующие степень проявления этого признака (J. Sun с соавт., 2022; X. Guo с соавт., 2023). Мы выполнили полногеномные ассоциативные исследования цветовых показателей мяса грудки у кур из F2 ресурсной популяции на основании данных полногеномного генотипирования. Цель работы - поиск SNPs и идентификация генов, ассоциированных с показателем цвета мяса у кур. Объектом изучения были куры F2 модельной ресурсной популяции ( n = 260, виварий ФИЦ животноводства - ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2021-2023 годы). Для получения популяции использовали две контрастные по мясным качествам породы кур - русскую белую (медленный рост) и корниш (быстрый рост). Генотипирование полученной птицы проводили с использованием чипов высокой плотности Illumina Chicken iSelect BeadChip 60k («Illumina Inc.», США). В возрасте 9 нед после экспериментального убоя птицы измерили характеристики мяса грудки по цветовой шкале L*a*b* с использованием портативного спектрофотометра CM-700d («Konica Minolta», Япония). На основании полученных данных гено- и фенотипирования выполнили полногеномные ассоциативные исследования, использовав программное обеспечение PLINK 1.9 с принятыми ограничениями (geno 0,1; mind 0,1; maf 0,03). В качестве порогового критерия достоверности установили p 2 ресурсная популяция кур характеризовалась высоким коэффициентом изменчивости по показателям зеленого (a*) и голубого (b*) участков спектров цвета мяса (от 19,99 % до 97,23 %). По показателю L вариабельность в исследованной популяции была относительно низкой (коэффициент изменчивости не превышал 9,75 %). На основании проведенного GWAS-анализа выявлено 60 значимых SNPs, в том числе ассоциированных с цветовым спектром: по L* - 28 SNPs, по a* - 48 SNPs, по b* - 4 SNPs. Указанные SNPs локализованы на хромосомах GGA1 (10 SNPs), GGA2 (3 SNPs), GGA3 (18 SNPs), GGA7 (2 SNPs), GGA8 (4 SNPs), GGA10 (2 SNPs), GGA12 (7 SNPs), GGA13 (9 SNPs), GGA17 (4 SNPs) и GGA18 (1 SNP). Идентифицированы 270 генов-кандидатов, связанных с изученными признаками, в 30 из этих генов были локализованы выявленные SNPs. Результаты исследования могут быть использованы в геномной селекции на улучшение качественных характеристик мяса кур.
Бесплатно
Статья научная
Сибирский осетр ( Acipenser baerii Brandt, 1869) - один из наиболее значимых видов рыб аквакультуры в России. Благодаря высокому спросу на ценную товарную продукцию, разведение сибирского осетра - перспективное направление в развитии отрасли. Однако селекционно-племенную работу с этим видом существенно осложняет наличие тетраплоидного генома, что в совокупности с необходимостью смешивания икры и спермы от нескольких производителей при получении потомства препятствует введению в практику хорошо зарекомендовавших себя молекулярно-генетических методов, таких как микросателлитный анализ. В настоящей работе впервые дана характеристика известным микросателлитным локусам у сибирского осетра с точки зрения возможности эффективного учета доз их аллелей в тетраплоидном геноме. Обнаружено семь локусов, соответствующих этому критерию. Целью нашей работы стало создание панели микросателлитных маркеров, адаптированной для использования в селекции сибирского осетра ленской популяции. Исследования проводили в 2023 году. В качестве биологического материала использовали срезы плавниковой ткани сибирского осетра ленской популяции, взятые от рыб экспериментального стада, содержащегося в установке замкнутого водоснабжения ФИЦ животноводства - ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста. Экспериментальное стадо содержало две группы: I - рыбы, полученные на Можайском производственно-экспериментальном рыбоводном заводе (д. Горетово, Можайский городской округ, Московская обл.; n = 42), II - рыбы, полученные от ООО РТФ «Диана» (рабочий пос. Кадуй, Кадуйский р-н, Вологодская обл.; n = 47). ДНК выделяли помощью набора ДНК-Экстран-2 (НПК «Синтол», Россия) согласно протоколу фирмы-производителя. Качественную оценку ДНК осуществляли методом электрофореза в агарозном геле (1,2 % агарозы). ПЦР выполняли на амплификаторе Thermal Cycler SimpliAmp («Thermo Fisher Scientific, Inc», США). Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в системе капиллярного электрофореза Нанофор 05 (НПК «Синтол», Россия). Размеры аллелей определяли с помощью программного обеспечения GeneMаrker (Version 3.0.1). Для каждого локуса определяли дозу каждого аллеля. Для тестирования использовали 27 микросателлитных маркеров: Ls 19, Aox 45, Aox 9, Ls 68, Agu 38, Ag 49a, Agu 37, Agu 41, Agu 15, Agu 51, Agu 59, Agu 34, Agu 36, Agu 46, Agu 56, Agu 54, AoxD 161, AfuG 63, AfuG 51, AfuG 112, An 20, Aru 13, Aru 18, Afu 68 b, Spl 163, AfuG41, Ls 39, ранее известных для осетровых видов рыб. Из них для включения в мультиплексные панели было отобрано семь (Agu 38, An 20, Aru 18, Ls 19, Ag 49a, Agu 37, Agu 41). На основании полиморфизма семи микросателлитных локусов для двух исследуемых групп особей сибирского осетра был выполнен расчет классических популяционно-генетических показателей: среднего числа аллелей на локус (Na = 6,86), числа эффективных аллелей (Ne = 3,61), наблюдаемой (Ho = 0,839) и ожидаемой (He = 0,6535) гетерозиготности. Выявлено отсутствие инбридинга в исследуемых группах (FIS = -0,340 и -0,173), а также наличие значительной генетической дифференциации между ними: значение генетической дистанции M. Nei составило 0,1340, индекс Fst = 0,0796. Группы сформировали два четких, практически не пересекающихся кластера на PCA-плоте, несмотря на то, что предки особей сибирского осетра у обеих групп имели изначально родственное происхождение. Был оценен вклад дозы аллеля тетраплоидного локуса в эффективность микросателлитного анализа: в среднем информативность каждого локуса повышалась на 32 %. Сопоставление результатов генетического анализа с имеющимися данными литературы позволяет предположить, что в аквакультуральных стадах сибирского осетра ленской популяции происходят процессы, связанные с изменением частот аллелей микросателлитных локусов, которые постепенно усиливают их генетическую дифференциацию. В результате работы была подтверждена высокая эффективность созданных панелей микросателлитных маркеров и их потенциальная пригодность для использования в генетической паспортизации - каждая особь сибирского осетра имела собственный генетический профиль. Распределение аллелей семи микросателлитных локусов указывало на формирование уникальной генетической структуры в стадах сибирского осетра в каждом из двух рыбоводных предприятий, которые были источниками рыбопосадочного материала.
Бесплатно
Статья научная
Аскорбиновая кислота (аскорбат, витамин С) играет важную роль в различных метаболических процессах и у растений, и у человека, поэтому увеличение содержания аскорбата в клетках растений при помощи селекционных подходов важно для повышения как пищевой ценности плодов, так и устойчивости растений к стрессу. Известно, что томат обладает высоким потенциалом как источник аскорбата в рационе человека. К сожалению, у современных сортов и гибридов томата овощного ( Solanum lycopersicum L.) содержание аскорбата в спелых плодах мало в сравнении с его дикорастущими родственными видами. Исследования показали, что селекционные программы с привлечением дикорастущих видов томата могут значительно увеличить содержание аскорбата в спелых плодах. Однако для эффективной селекции по этому признаку необходимо более детальное изучение генетических детерминант, ответственных за накопление аскорбата в спелых плодах. В представляемой работе нами впервые амплифицированы, клонированы и секвенированы гомологи гена GME1, играющего ключевую роль в биосинтезе аскорбата, у томата овощного и 11 дикорастущих видов томата. Структурный анализ показал низкую степень вариабельности гена GME1 у изученных образцов. В кодирующих последовательностях GME1 выявлено 28 однонуклеотидных замен (single nucleotide polymorphisms, SNPs), из которых только две (G2E и E281D) приводили к несинонимичным заменам у видов S. neorickii и S. peruvianum var. dentatum. Анализ мотивов и доменов белка GME1 томатов не выявил каких-либо специфических мотивов ни на межвидовом уровне, ни на более отдаленных таксономических уровнях. Наблюдаемый высокий консерватизм GME1 у достаточно эволюционно отдаленных видов томата, по всей видимости, служит свидетельством функциональной значимости этого фермента для синтеза аскорбата и, опосредованно, для защиты от стрессовых факторов, прежде всего фотостресса. Корреляцию между аминокислотными (нуклеотидными) заменами и содержанием аскорбата в плодах мы не обнаружили. При сравнительном межвидовом органоспецифическом анализе и анализе зависимости количества аскорбата в зрелых плодах у сортов и дикорастущих образцов от уровня экспрессии GME1 мы также не выявили связи между транскрипционной активностью GME1 и концентрацией аскорбата. Можно также предположить, что определяющее влияние на конечное содержание аскорбата в созревшем плоде томата, вероятно, оказывает не интенсивность экспрессии GME1 на завершающей стадии созревания плода, а то, насколько ген GME1 был активен на более ранних стадиях созревания.
Бесплатно
Статья научная
Картофель ( Solanum tuberosum L.) - четвертая по значимости сельскохозяйственная культура после зерновых. У растения картофеля почти в каждой ткани содержится крахмал, регуляция метаболизма и физиологическая роль которого зависят от типа ткани, стадии развития растения и внешних факторов. Гидролиз крахмала катализируется α- (AMY) и β- (BAM) амилазами. Посредством деградации цитозольного фитогликогена амилаза StAmy23 регулирует холодовое осахаривание и состояние физиологического покоя клубней картофеля. Немногочисленные имеющиеся исследования StAmy23 сосредоточены на активности гена в клубнях картофеля, в том числе в ответ на холодовой стресс. В настоящей работе впервые определен паттерн экспрессии гена StAmy23 в фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих органах растений картофеля трех сортов, различающихся содержанием крахмала в клубнях, - Gala (среднеранний) и Saturna (среднепоздний) (сорта зарубежной селекции) и Барин (среднеспелый российский сорт). Структурно-филогенетический анализ выявил, что ближайшими гомологами StAmy23 являются α-амилазы разных сортов картофеля и томата. Определение количества углеводов в свежесобранных клубнях исследуемых сортов выявило сходное высокое содержание крахмала у сортов Gala и Saturna, в клубнях сорта Барин этот показатель был почти в 2 раза ниже (6,3 против 11,34 мг/г ткани). Наибольшее количество редуцирующих сахаров в клубнях мы обнаружили у сорта Saturna; клубни сорта Gala содержали соответственно в 4,5 и в 24,5 раза меньше глюкозы/фруктозы, чем клубни сортов Барин и Saturna (0,016/0,000 против 0,056/0,016 и 0,217/0,175 мг/г ткани). Нами впервые определен профиль экспрессии StAmy23 не только в клубнях, стеблях и листьях, но и в других органах и тканях растения картофеля. Показан высокий уровень экспрессии гена в стеблях и ягодах. Уровень транскрипции StAmy23 в нефотосинтезирующих корнях и столонах либо соответствовал таковому в клубнях (Saturna), либо значительно превышал его (Барин и Gala). В стеблях наибольшую и наименьшую активность транскрипции StAmy23 отмечали соответственно у сортов Gala и Saturna (0,58 и 0,13). Листья и кожура характеризовались сходным и сравнительно низким уровнем экспрессии StAmy23 . Самый высокий уровень экспрессии гена StAmy23 в ягодах выявили у сорта Барин (0,29), в корнях и клубнях у сорта Gala (0,55 и 0,17) и в столонах у сортов Барин и Gala (0,31 и 0,33). Между уровнем транскрипции StAmy23 и содержанием крахмала (но не содержанием редуцирующих сахаров) в клубнях наблюдалась явная положительная зависимость. Транскрипционная активность гена StAmy23 в фотосинтезирующих тканях растений картофеля предполагает участие кодируемой им α-амилазы в гидролизе крахмала не только в запасающих, но и в вегетативных органах для поддержания физиологических процессов роста и ответа растений на стресс.
Бесплатно
Статья научная
Породы корниш и плимутрок составляют основу современных специализированных мясных кроссов кур. Селекция отцовской линия породы корниш СМ5 нового российского кросса мясных кур Смена 9 ведется в основном по признакам мясной продуктивности, тогда как материнская линия породы плимутрок СМ9 - прежде всего на эффективность репродукции и жизнеспособность при более низкой, чем у линии СМ5, скорости роста живой массы. В настоящем исследовании мы впервые выявили у кур и петухов родительского поголвья линий СМ5 и СМ9 нового кросса Смена 9 различия, связанные с генотипом и полом, в экспрессии некоторых генов иммунитета и генов, связанных с адаптационным потенциалом, а также в составе и прогнозируемом функциональном потенциале микробиома. Целью работы было сравнение уровня экспрессии генов иммунитета и генов, связанных с адаптационным потенциалом, соответственно в тканях бурсы в печени, а также состава и функций микробиома слепых отростков кишечника у кур и петухов линий СМ5 и СМ9. Эксперименты проводили в виварии СГЦ «Загорское ЭПХ» (Московская обл., 2022 год) на родительском поголовье кур и петухов линий СМ5 и СМ9 39-недельного возраста, содержавшихся в идентичных условиях и получавших одинаковый рацион. От каждой линии и пола отбирали образцы тканей у 5 особей с близкой живой массой. Анализ экспрессии генов в образцах тканей проводили с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Тотальную РНК выделяли с помощью мини-набора Aurum™ Total RNA («Bio-Rad», США). ПЦР-амплификацию проводили с использованием SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix («Bio-Rad», США) и детектирующего амплификатора ДТлайт (НПО «ДНК-Технология», Россия). В тканях печени проводили анализ экспрессии генов, связанных с адаптационным потенциалом: гены CAT1 транспортера катионных аминокислот 1, HSF1 и HSF 2 - факторов транскрипции белков теплового шока 1 и 2, SOD - супероксиддисмутазы, Gpx1 - глутатионпероксидазы, HO-1 - гемоксигеназы-1. В тканях бурсы анализировали экспрессию генов, связанных с иммунитетом: гены IL8 - интерлейкина-8, IRF7 - регуляторного фактора интерферона 7, PTGS2 - простагландин-эндопероксидсинтазы, AvBD1 , AvBD2 , AvBD9 и AvBD10 - β-дефензины 1, 2, 9 и 10, Casp6 - каспазы 6. В качестве референсного контроля использовали праймер для гена β-актина ( ACTB ). Относительный уровень экспрессии оценивали методом 2-ΔΔCT. Тотальную ДНК для анализа состава микробиома выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Бактериальное сообщество слепой кишки оценивали методом NGS-секвенирования на платформе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с праймерами для V3-V4 региона гена 16S рРНК. Реконструкцию и прогнозирование функционального содержания метагенома, семейств генов, ферментов осуществляли при помощи программного комплекса PICRUSt2 (v. 2.3.0). Математическую и статистическую обработку результатов осуществляли методом многофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в программах Microsoft Excel XP/2003 и R-Studio (v. 1.1.453). Полученные результаты показали увеличение экспрессии генов HSF1 и HSF2 у петухов линии СМ5 по сравнению с остальными группами (р ≤ 0,05), в часности, разница с петухами линии СМ9 составляла соответственно 68 и 218 % (р ≤ 0,05). Экспрессия генов HSF1 и HSF2 внутри линии СМ5 у петухов была выше соответственно в 1,6 и 3,0 раза, чем у кур (р ≤ 0,05). Наблюдалась существенная активация экспрессии генов антимикробных пептидов и провоспалительных генов у петухов линии СМ9 по сравнению с петухами и курами линии СМ5 (р ≤ 0,05). Так, экспрессия генов AvBD2 , AvBD9 , AvBD10 , IL8 и PTGS2 у петухов линии СМ9 по сравнению с петухами линии СМ5 усиливалась соответственно в 7,6; 5,3; 2,1; 6,3 и 1,5 раза (р ≤ 0,05). NGS-секвенирование показало, что в микробиоме слепых отростков кишечника у кур и петухов линии СМ9 присутствовали бактерии суперфилума Elusimicrobiota (соответственно 0,32±0,11 и 0,49±0,19 %), при этом у петухов линии СМ5 эти микроорганизмы не были выявлены, а у кур линии СМ5 их доля составляла 0,04±0,01 %. Между группами были обнаружены достоверные (р ≤ 0,05) различия по 25 родам, у части родов - в зависимости от генотипа, у части - от пола птицы. Например, у петухов линии СМ5 обилие микроорганизмов родов Barnesiella , Clostridia_UCG-014 и Frisingicoccus было соответственно в 17,2; 2,0 и 4,9 раза выше (р ≤ 0,05), чем у петухов линии СМ9. Представители рода Desulfovibrio присутствовали в кишечнике петухов линий СМ5 и СМ9 (0,25±0,08 и 0,73±5,6 %); при этом в кишечнике кур обеих линий этих микроорганизмов мы не обнаружили. По результатам биоинформатической реконструкции и функциональной аннотации данных NGS-секвенирования в микробном сообществе кишечника выявлены 357 прогнозируемых метаболических путей, по 65 из которых наблюдались различия (р ≤ 0,05) между группами. Специфические для генотипа и пола модуляции в экспрессии генов, а также в структуре и функциях кишечного микробиома могут обеспечивать адаптацию макроорганизма в изменяющихся условиях.
Бесплатно
