Биотехнологическая переработка отходов производства птицы в ценный кормовой белково-пробиотический концентрат

На сегодняшний день российское животноводство, в частности птицефабрики, испытывает недостаток полноценных кормов, что ведет к несбалансированному составу и недостатку белка, а вследствие, происходит снижение генетического потенциала продуктивности животных. Объемы животноводства и птицеводства с каждым годом только растут. На протяжении последних восьми лет с 2012–2020 гг. наблюдается устойчивый прирост поголовья птицы (см. рисунок).

Анализируя прирост за представленные года (2012–2020 гг.), ожидаемое количество производства птицы за 2021 год на убой в жи- вом весе составит 6800 тыс. тонн, а в убойном весе 5066 тыс. тонн.

Можно увидеть динамику увеличения производства мяса и птицы, что указывает на необходимость использования кормов и кормовых добавок для роста, развития и здоровья домашнего скота. Высокое содержание в кормовой муке белков, жиров и минеральных веществ обусловливает ее ценность как продукта для скармливания сельскохозяйственным животным и птицам. Главная задача таких добавок – это улучшение использования питательных веществ при его минимальных затратах на единицу продукции.

о 6000 5000 4000

s 3000 о 2000 § 1000

5585    60396191

4875    5152                                 4941    4980    50075012

3632    3839    4164    45414622

2012   2013   2014   2015   2016   2017   2018   2019   2020

Годы

• ■ на убой в живом весе ■ в убойном весе

  Производство мяса птицы в России за 2012–2020 гг.

Высокая стоимость и дефицит традиционных кормов для рациона птицы вынуждают производителей искать альтернативное сырье или новые способы переработки отходов. Для решения этой постоянно растущей и сохраняющейся проблемы необходимо разработать экологически чистые и безотходные технологии. Использование отходов с целью обогащения их микробным белком позволит расширить сырьевую базу для получения кормовых продуктов и сократить сроки выращивания поголовья птицы предположительно на 1– 2 дня, что положительно повлияет на экономику производства.

Отходы животноводства необходимо не только перерабатывать различными способами (биотехнологический, термохимический) [1, 2], но и утилизировать, так как это одна из причин загрязнения атмосферы. Проблема экологии на данный момент стоит на первом месте. Изучая статистику образующихся отходов производства животноводства, поднимается вопрос их утилизации или переработки. Известно, что одна птицефабрика емкостью 400 тысяч кур за год вырабатывает такое количество птичьего помета, что в процессе его разложения в атмосферу выделяется почти 700 тонн биологического газа, где 450 тонн составляет метан (65 %), 208 тонн углекислый газ (30 %), 35 тонн сероводород, аммиак и другие соединения (5 %) [3].

Для снижения выбросов метана в сельском хозяйстве необходимо производить растительное «мясо», улучшать селекцию жи- вотных, давать им специализированный корм для снижения желудочной ферментации и совершенствовать системы хранения навоза [4].

Приблизительный ежегодный экономический ущерб, приносимый экосистеме такими выбросами, составляет 440 миллионов рублей. Поэтому одним из актуальных становится вопрос о разработке методов переработки и утилизации животноводческих отходов.

В настоящее время существуют следующие способы утилизации [5]: ввоз нативного помета, стоков и навоза на поля; компостирование; переработка помета и навоза на корма; биоэнергетические методы и инновационные технологии утилизации и так далее. Недостатками многих способов утилизации являются высокая стоимость транспортировки больших объемов отходов на поля, заражение почвы, подземных и поверхностных вод инфекционными и токсическими веществами, накопление нитратов, меди и цинка в траве и водных источников.

Каждый вид отходов является сырьем, пригодным для переработки микробиологическим синтезом, с получением при этом ценного пищевого продукта [6]. Например, в работе [7] рассмотрен вариант использования, высушенного или обработанного в автоклаве птичьего помета в качестве корма для птицы. Использование такого корма позволило повысить его усвояемость и массу тела цыплят. Неиспользованные скоропортящиеся белковые отходы – это не только потеря ценного белкового сырья, а и загрязнение окружающей среды.

Помимо вышеупомянутых способов существуют и биотехнологические способы утилизации отходов, имеющие значительные преимущества перед компостированием за счет того, что снижаются потери питательных веществ в перерабатываемом исходном сырье, значительно повышается уровень экологической чистоты конечных (вторичных) продуктов и сокращения времени переработки сырья. Поэтому наиболее перспективным методом утилизации отходов птичьего производства является переработка отходов в корма [8]. Такой способ позволяет быстро перерабатывать достаточно большое количество отходов. К примеру, существует большое количество микроорганизмов, способных потреблять отходы сельского хозяйства и образовывать микробную биомассу. Самыми перспективными являются быстрорастущие микроорганизмы, такие как M. thermophila, T. lanugi-nosus, H. grisea и G. humicolа и дрожжи (представители рода Rhodotorula ). Считается, что одним из направлений биотехнологии во всем мире является разработка и усовершенствование технологий производства биопрепаратов на основе бактерий рода Bacillus [9]. Практика применения пробиотиков на основе B. subtilis и B. licheniformis, объемы их закупок за рубежом и реализация показывают, что спрос на данные препараты значительно превышает предложение. В работе [10], например, бактерии Bacillus subtilis были использованы для приготовления питательных сред.

Следовательно, актуальной задачей как с экологической, так и с экономической точки зрения является утилизация отходов пищевой промышленности, содержащих белки.

Целью исследования являлось получение и оптимизация новой питательной среды на основе гидролизата перьевой муки для эффективного культивирования Bacillus subtilis с целью получения ценного белково-пробиотического концентрата для использования в качестве кормовой добавки.

Объекты и методы исследования

Объектом настоящего исследования была выбрана перьевая мука, которая ранее была подвергнута бескислотному гидролизу на производстве. Такая мука представляла собой сыпучую массу, содержащую сырой протеин 60–65 % (источник белка, фосфора и аминокислот), ценные компоненты, обеспечиваю- щие полноценный рацион питания. Именно поэтому она может быть использована в качестве компонента питательной среды. Полученная перьевая мука далее подвергается кислотному гидролизу. Гидролиз проходил в паровом стерилизаторе (ПЗ ВКа-75-ПЗ) при t = 121 °C, p = 1,52 бар. Гидролизат перьевой муки является потенциальным источником аминного азота, так как сырой протеин в ходе обработки превращается в аминный азот. Нами варьировалась концентрация HCl до тех пор, пока в результате содержание аминного азота не достигло 4 г/л. Первоначально для приготовления гидролизатов использовалась соляная кислота концентрацией 3 и 6 % при соотношениях перьевая мука, г : кислота, мл 1:10 и 1:15 при t = 121 °C, p = 1,52 бар. Самое высокое содержание аминного азота было найдено при гидролизе 6 % соляной кислотой при соотношении перьевая мука, г : кислота, мл 1:10. Для улучшения полученных результатов были выбраны концентрации соляной кислоты 5 и 10 % и соотношение перьевая мука, г : кислота, мл 1:10. Гидролиз проводился в стерилизаторе с последующей фильтрацией. Для ускорения процесса фильтрацию проводили сразу после гидролиза. После к гидролизату добавлялась щелочь для доведения рН до рН нейтральной среды.

В гидролизате было проанализировано содержание аминного азота (FAN) двумя методами: нингидриновым и методом формольного титрования. Определение содержания аминного азота нингидриновым методом осуществляли фотоколориметрически. Измеренные значения оптических плотностей испытуемого и стандартного растворов подставляли в формулу:

FAN = ·2·dilution. (1) net absorbans of glycine std

Методом формольного титрования такой азот вычислялся по формуле m =

V₂хК_с,„ _л„,хо,о 14100 ^{z   G} (N aO H )   '

v3 :

где V₂ - объем раствора гидроксида натрия, израсходованный на титрование испытуемой пробы, мл; К – поправочный коэффициент к титру раствора гидроксида натрия концентрации С ( _Nа0н^ = 0,1 моль/л; V₃ - объем гидролизата, используемый для анализа, мл; 100 – коэффициент пересчета в проценты; 0,0014 – количество азота, соответствующее

• 1    мл раствора гидроксида натрия концентрации 0,1 моль/л.

Минеральный состав в готовом гидролизате определялся методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (MS-ICP).

Далее полученный гидролизат был использован в качестве компонента питательных сред, получение и оптимизация которых было предметом нашего исследования.

Для посева использовались бактерии Bacillus subtilis. Выбор данной бактерии обусловлен тем, что она хорошо культивируется и прекрасно наращивает биомассу, которая может выступать в качестве целевого пробиотического продукта.

Все работы проводились в асептических условиях. В качестве эталонного продукта использовался лиофилизированный штамм Bacillus subtilis из коллекции НПЦ ООО «Уралбио-синтез». Препарат разводили по стандартной прописи для лиофилизатов в 2 мл физиологического раствора. Штамм высевался на плотную питательную среду мясо-пептонного агара. Культивирование проводилось при t = 37 °C в течение 48 часов. Была получена чистая культура без посторонней микрофлоры. Общее количество бактериальных спор было более 70 %. Далее полученная культура использовалась для культивирования на жидких средах. В качестве источника азота был использован гидролизат казеина. Источником же углерода выступала глюкоза. Компонентный состав был взят из литературы, где было предложено несколько вариантов состава [10].

Ранее в [10] было показано, что максимальный выход биомассы бацилл был получен в вариантах сред: В 1 , содержащей 0,17 г/л ГСМ; 16 г/л глюкозы; 0,1 г/л MgSO 4 × 7H 2 O; 0,01 г/л MnSO 4 × 5H 2 O; 0,4 г/л CaCl 2 × 6H 2 O; 0,001 г/л FeSO 4 × 7H 2 O; 1,0 г/л NaCl. Для установления оптимального состава по ряду показателей нами была выбрана B 1 . Приготовленная среда стерилизовалась при 121 °C в течение 30 минут. Культивирование проводилось при температуре 37 °C в течение 48 часов.

После готовился посевной материал. Целью данного опыта была проверка возможности использования нейтрального гидролизата перьевой муки (ГПМ) в качестве источника аминного азота. Для приготовления питательной среды брали разное количество разведенного гидролизата для получения оптимального содержания аминного азота, соли и глюкоза были взяты в тех же самых количествах, что и в описанных ранее экспериментах. В 100 мл подготовленной среды добавлялось 10 мл посевного материала в стерильных условиях. Культивирование проводилось при 37 °C в течение 48 часов в шейкере-инкубаторе с частотой вращения 160 об/мин.

Результаты и их обсуждение

Для использования ГПМ в качестве источника аминного азота в питательной среде содержание аминного азота должно быть не менее 4 г/л. Данной концентрации удалось достичь, использовав 10 % соляную кислоту в соотношении перьевая мука, г : кислота, мл 1:10. Для сравнения результатов кроме перьевой муки Рефтинской птицефабрики была проанализирована также перьевая мука Белгородской птицефабрики (РПМ – рефтинская перьевая мука, БПМ – белгородская перьевая мука).

Результаты анализа на аминный азот представлены в табл. 1.

Из таблицы видно, что при нингидриновом методе с разбавлением гидролизата в результате анализа увеличивается содержание аминного азота. Содержание аминного азота, определенное этим методом, было несколько меньше, чем в случае формольного титрования. Результаты анализа, полученные из формольного титрования, приведены в табл. 2.

Методом Кьедаля были получены массовые доли белка двух образцов (О РП = 6,9 %, 03 БП = 7,96 %.

Нами в дальнейшем планируется использовать данный продукт в качестве кормовой добавки, поэтому необходимо знать аминокислотный состав в гидролизате. Некоторые аминокислоты важны для продуктивности птиц, такие как аргинин, валин, изолейцин. Аминокислотный состав полученных гидролизатов приведен в табл. 3.

В табл. 4 приведены рассчитанные содержания (в %) каждой аминокислоты в РПМ (рефтинская перьевая мука), БПМ (белгородская перьевая мука) и ГСМ (гидролизат соевой муки).

Гидролизаты соевой и белгородской муки использовали для сравнения. Как видно из таблиц, содержание большинства аминокислот больше у гидролизата соевой муки, но в то же время содержание таких аминокислот, как: глицин + треонин, цистин и пролин больше у РПМ и БПМ по сравнению с ГСМ. Целесообразно было сравнивать РПМ и БПМ, где у РПМ содержание аргинина, валина, изолейцина было выше. Аргинин не продуциру-

Таблица 1

Содержание аминного азота в гидролизате перьевой муки при различных условиях и методах определения

Используемый метод, разбавление	Содержание аминного азота (г/л)
	Концентрация соляной кислоты	РПМ	БПМ
Формольное титрование	Сна = 10 %, 1:10	4,41	4,9
Нингидриновый метод (0,1 мл к 10 мл)	СHCl = 10 %, 1:10	2,77	2,87
Нингидриновый метод (0,1 мл к 20 мл)	СHCl = 10 %, 1:10	3,18	3,44
Нингидриновый метод (0,1 мл к 40 мл)	СHCl = 10 %, 1:10	3,19	3,54
Нингидриновый метод (0,1 мл к 80 мл)	СHCl = 10 %, 1:10	3,25	3,79
Нингидриновый метод (0,1 мл к 100 мл)	СHCl = 10 %, 1:10	3,43	3,81

Таблица 2

Содержание аминного азота по данным формольного титрования

Анализируемая мука	Массовая доля аминного азота, мг/100 мл	Массовая доля аминного азота, г/л
ГПМ Рефтинской птицефабрики	491,3 ± 0,6	4,913 ± 0,6
ГПМ Белгородской птицефабрики	513,3 ± 0,5	5,133 ± 0,5

Таблица 3

Содержание аминокислот в гидролизатах, мкг/мл

Номер	Аминокислота	ГСМ [7]	РПМ	БПМ
1	Валин	2476 ± 74	725 ± 163	453 ± 58
2	Изолейцин	1884 ± 57	399 ± 97	263 ± 21
3	Лейцин	5295 ± 159	1423 ± 76	1090 ± 10
4	Лизин	3300 ± 99	1545 ± 252	347 ± 58
5	Аспарагиновая	6838 ± 205	4409 ± 118	3063 ± 57
6	Глутаминовая	9487 ± 285	3543 ± 804	2360 ± 441
7	Серин	2645 ± 79	1790 ± 142	2177 ± 191
8	Гистидин	844 ± 25	268 ± 20	110 ± 46
	Глицин	–	2941 ± 359	2313 ± 186
	Треонин	–	1093 ± 183	907 ± 133
9	Глицин + треонин	2070 ± 62	4034 ± 542	3220 ± 319
10	Аргинин	3967 ± 119	1163 ± 272	747 ± 42
11	Аланин	5229 ± 157	1777 ± 142	1030 ± 113
12	Тирозин	1824 ± 55	781 ± 57	670 ± 36
13	Метионин	959 ± 29	378 ± 54	207 ± 81
14	Цистин	–	273 ± 72	407 ± 61

Окончание табл. 3

Номер	Аминокислота	ГСМ [7]	РПМ	БПМ
15	Пролин	—	1653 ± 300	1207 ± 488
16	Фенилаланин	2984 ± 90	923 ± 40	640 ± 104
17	Сумма аминокислот	49802	25084	17990

Таблица 4

Содержание аминокислот в гидролизатах, %

Номер Аминокислота ГСМ [7] РПМ БПМ 1 Валин 4,97 2,89 2,52 2 Изолейцин 3,80 1,59 1,46 3 Лейцин 10,64 5,67 6,06 4 Лизин 6,55 6,16 1,93 5 Аспарагиновая 13,67 17,58 17,03 6 Глутаминовая 19,00 14,12 13,12 7 Серин 5,32 7,14 12,10 8 Гистидин 1,73 1,07 0,61 Глицин – 11,72 12,86 Треонин – 4,36 5,04 9 Глицин + треонин 4,21 16,08 17,89 10 Аргинин 8,03 4,64 4,15 11 Аланин 10,48 7,08 5,73 12 Тирозин 3,66 3,11 3,72 13 Метионин 1,88 1,51 1,15 14 Цистин – 1,09 2,26 15 Пролин – 6,59 6,71 16 Фенилаланин 5,96 3,68 3,56 17 Сумма аминокислот 100,00 100,00 100,00 пробиотического продукта. Полученный осветленный жидкий продукт не уступал в ростовых и накопительных (по биомассе) характеристиках таким продуктам, как соевый

и кукурузный ферментативный гидролизат.

Таким образом, полученный гидролизат может быть использован в качестве источника азота при приготовлении питательной среды.