Биотехнология получения легкоусвояемых сахаров из зерна для животноводства

Введение . Зерно злаковых растений широко используется в кормлении сельскохозяйственных животных. В различных видах и сортах зерновых растений содержится от 50 до 70 % крахмала [1,2].

Процесс расщепления крахмала до глюкозы в желудочно-кишечном тракте животных является высокоэнергозатратным, поэтому целесообразнее сначала получать из зерна легкоусвояемые сахара и затем включать их в рацион животных. Сущность процесса заключается в ферментативном гидролизе крахмала, под действием амилолитических ферментов, вырабатываемых пищеварительными железами и собственно микроорганизмами.

Ферменты микробиологического происхождения широко используются в животноводстве для получения легкоусвояемых сахаров из крахмала. Процесс переработки состоит из механической подготовки зерна в кавитаторе или экструдере и ферментативного гидролиза крахмала [1–3]. Использование микроорганизмов, продуцирующих амилолитический фермент в гидролизе крахмала, является альтернативной технологией к технологии микробиологической биоконверсии, при этом сырье для производства кормовой добавки проходит обработку в среде, аналогичной микрофлоре рубца и начального участка пищеварительного тракта [4], т. е. первый этап пищеварения - подготовка корма к перевариванию начинается вне организма. Отсутствующие в пищеварительном тракте животного ферменты компенсированы ферментами микроорганизмов. Поэтому процесс переваривания таких кормов непосредственно в кишечнике животных характеризуется высоким уровнем биологических процессов и переваримостью корма, а также сниженными ферментными и энергетическими затратами организма на всех этапах пищеварения. Полностью исключается необходимость запаривания или увлажнения кормов перед скармливанием. Кроме того, культивируемые микроорганизмы, предназначенные для кормовых и лечебно-профилактических целей [5], представляют интерес по двум причинам. Во-первых, они растут очень быстро: время удвоения численности микроорганизмов измеряется часами или даже минутами. Во-вторых, в зависимости от выращиваемых микроорганизмов в качестве субстратов для питательных сред могут использоваться разнообразные виды сырья.

Что касается субстратов, то современные технологии идут по двум главным направлениям [6, 7]: переработка низкокачественных бросовых продуктов или же использование легкодоступных углеводов с целью получения за их счет микробной биомассы, содержащей высококачественный белок. Гидролизованное микробиологическим путем зерновое сырье является хорошей питательной средой для культивирования микроорганизмов, относящихся к группе молочнокислых [8]. Данная группа обладает выраженными антогонистическими свойствами по отношению к микроорганизмам энтеропатоген-ной группы (кишечная палочка, синегнойная палочка, протей, клебсиелла и др.). При этом культивируемые молочные микроорганизмы способны сами синтезировать ряд витаминов и биологически активных веществ. Тем самым, на основе зернового сырья, подвергнутого биоконверсии, можно получать кормовые добавки, содержащие моносахара и биологически активные компоненты, обладающие лечебно-профилактическим эффектом, что особенно актуально при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных [9, 10]. В связи с вышеизложенным проблема поиска новых альтернативных способов получения кормовых продуктов, повышающих качество исходного сырья при снижении затрат на их производство, а также разработка биотехнологических принципов переработки различных видов зерна актуальна и является одной из главных задач для ученых, работающих в агропромышленном секторе России.

Цель исследования : разработка технологии получения легкоусвояемых сахаров из зерна с использованием культуры микроорганизмов.

В задачи исследования входило изучение влияния цикла развития микроорганизмов, продуцирующих амилолитический фермент на степень осахаривания крахмала в зерне и определение биохимического состава гидролизата из зернового сырья.

Материалы и методы исследования . Исследования проведены в 2015–2017 гг. в лаборатории Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского ГАУ. Идентификация микроорганизмов, обладающих амилолитическими свойствами, из представленного нами материала проведена в ФГУП ГосНИИгенетика (г. Москва). Каждому штамму присвоен номер и дано название: Bacillus subtilis № 2 – amylolitic , Bacillus subtilis № 9 – amylolitic и Bacillus subtilis № 12 – amylolitic . Штаммы приняты на национальное патентное депонирование во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ).

В качестве зернового сырья использовали зерновую смесь (пшеница+овес). Смесь заливали водой, доводили до кипения, охлаждали до t = 75 оС и добавляли споры микроорганизмов. Ферментативный гидролиз крахмала осуществляли при помощи смеси штаммов микроорганизма Bacillus subtilis: № 2 – amylolytic, № 9 – amylolytic и № 12 – amylolytic. Гидролиз сырья проводили в термостате при температуре 40 оС в течение одних суток. Степень осахаривания крахмала контролировали по наличию цветной реакции с 0,02 н. водным раствором йода и раствором Люголя. Определение биохимического состава гидролизата проводили в научно-исследовательском испытательном центре по контролю качества сельскохозяйственно- го сырья и пищевых продуктов при Красноярском государственном аграрном университете. Определение токсичности продукта – в испытательной лаборатории Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Красноярск). Микроскопию и фотографирование изучаемого материала проводили при помощи микроскопа «Микмед-6» с тринокулярной насадкой и цифрового фотоаппарата Canon-А520, имеющего программное обеспечение для компьютерной обработки получаемых изображений. Статистический анализ полученных данных проводили при помощи математических функций в электронных таблицах Ms Excel.

Результаты исследования и их обсуждение . В результате изучения цикла развития микроорганизмов, продуцирующих амилолитические ферменты, установлено, что при попадании спор на питательную среду они претерпевали ряд последовательных преобразований. Происходило созревание спор, они увеличивались в размерах, приобретали яйцевидную форму, при окрашивании раствором Люголя приобретали перламутровый зеленый цвет. Лаг-фаза длилась 12 ч, после чего споры со стороны более острого конца начинали прорастать, что характеризовалось появлением из споры палочки. При прорастании спор происходило выделение фермента, который разжижал крахмальный клейстер. Прорастание спор сопровождалось образованием углекислого газа и соответственно появлением пены на поверхности клейстера. Крахмальный клейстер становился жидким, как вода, но не прозрачным. При микроскопировании капли клейстера в нем обнаруживали короткие палочки, по форме напоминающие сигары с терминальным расположением споры. Осахаривание крахмала происходило в течение второй половины суток от момента внесения в него спор. В это время происходил рост и деление палочек. Через 14 ч палочки удлинялись, в них формировалась гранулеза, и по мере роста палочек в гранулезе появлялись от одного до трех разрывов. Гранулеза, представляющая крахмалоподобное вещество, хорошо окрашивалась раствором Люголя в темно-синий цвет. Через 18 ч от начала культивирования спора на конце палочки исчезала, а макронуклеус вместе с гранулезой расходились от центра к противоположным концам палочки.

Далее развитие микробных клеток происходило по одному из двух путей. Одна часть кле- ток, лишенных споры, начинала делиться. При этом образовавшиеся дочерние клетки могли располагаться друг к другу как под углом, так и могли выстраиваться друг за другом, образуя короткие цепочки. Через 20 от начала опыта у дочерних палочек на одном конце палочки появлялась спора. Другая же часть палочек удлинялась, истончалась и образовывала так называемые нити, которые часто сплетались в клубки. Спор у этих палочек не появлялось.

Заканчивался цикл развития у этих двух групп палочек по-разному. У той группы палочек, у которых образовывались споры в дальнейшем, тело палочки растворялось, и оставались только споры, а палочки, которые образовывали нити, растворялись без остатка. Исчезновение палочек происходило через 24 от начала культивирования. Во время своего роста и деления бактерии выделяли в окружающую среду сначала разжижающий фермент, затем осахаривающий фермент, амилоза и амилопектин крахмала расщеплялись до молекул мальтозы и далее до глюкозы. При изучении динамики изменения окрашивания крахмального клейстера препаратами йода были получены следующие результаты: 0,02 н. водный раствор йода по мере расщепления амилозы и амилопектина до мальтозы и глюкозы изменял свою окраску следующим образом – фиолетовый, сиреневый, розовый, оранжевый, желтый и бесцветный. Раствор Люголя соответственно окрашивался: в темно-синий, гранатовый, темнокоричневый, ржаво-коричневый, янтарножелтый. Темно-синий и фиолетовый цвета свидетельствовали о присутствии в растворе молекул крахмала, сиреневый и коричневый цвета – о наличии декстринов, а розовый, оранжевый, желтый цвета и обесцвечивание – о наличии сахаров.

Осахаривание крахмала ферментами бактерий заканчивалось к концу первых суток после начала опыта. К концу суток палочки со спорой начинали бледнеть, истончаться и исчезать, но споры оставались и переходили в неактивную стадию хранения. Они вновь становились круглыми, уменьшались в размере, у них исчезал перламутровый зеленый цвет. Другая же часть палочек, которая перешла ранее в состояние нитей, в дальнейшем растворялась без остатка. Гидролизат, полученный методом ферментиро- вания полисахаров зернового сырья с использованием амилолитических микроорганизмов, имел густую консистенцию, коричневый цвет и сладкий вкус.

Один литр гидролизата после упаривания (патока) имел массу 1 кг 250 г. Побочным продуктом биотехнологического процесса были декстрины с оболочками зерна. Масса декстринов в сушеном виде составлял 750 г.

При исследовании биохимического состава патоки из экструдированной зерновой смеси установлено, что количество общего сахара в патоке составило 24,22 %, а в пересчете на сухое вещество – 68,28 %. Помимо сахаров, в продукте содержался белок – 2,28 %, а в пересчете на сухое вещество – 6,41 %. Препарат обладает большой энергетической ценностью, один килограмм препарата содержит 1,2 кормовой единицы. Кроме биохимических веществ патока содержала используемые при ее изготовлении микроорганизмы. Испытание патоки на токсичность показало, что патока не обладает токсическими свойствами. В отношении перспектив развития метода можно предложить исключить из процесса приготовления патоки процесс фильтрации, тогда в конечном продукте повысится содержание доли растительного белка (максимально до 10 %). Резервом для увеличения выхода сахаров из зернового сырья является гидролиз целлюлозы [12]. Из целлюлозы состоят плодовая и семенная оболочки зерновки, а также оболочки клеток алейронового слоя. Целлюлозы содержится в десять раз меньше, чем крахмала, – всего 5–10 % от массы зерна. Расщепление целлюлозы до легкоусвояемых сахаров возможно при использовании целлюлозолитических микроорганизмов. Но данная проблема на сегодняшний день еще не решена нигде в мире, даже в условиях лаборатории.

Выводы. Разработана технология получения легкоусвояемых сахаров из зерна для животноводства. Источником ферментов служат штаммы микроорганизма Bacillus subtilis , способные продуцировать амилолитический фермент.

Эти штаммы могут применяться при производстве зерновой патоки для применения ее в животноводстве с целью ликвидации дефицита углеводов в организме сельскохозяйственных животных.