Четырехклассная систематизация биокриоконсервантов. II класс хладоограждающих растворов - экзоцеллюлярные криоконсерванты.

Цель настоящей работы — ознакомление широкого круга ученых и практиков, посвятивших себя решению сложных проблем трансфузионной криобиологии, со II классом хладоограждающих растворов.

Материалы и методы. II класс хладоограждающих растворов образован криоконсервантами, не проникающими в клетки [1]. Растворы не проникающих в клетки органических веществ, как правило, обладают слабыми хладозащитными свойствами и низкой токсичностью на клеточном и организменном уровне [1]. Содержат по одному (моно-) или два (би-) криоконсерванта экзоцеллю-лярного действия. Трансфузиологический интерес к экзоцеллюлярным криопротекторам не ослабевает, так как на их основе можно синтезировать биокриоконсерванты не требующие удаления из отогретой клеточной взвеси. Из числа криопротекторов, входящих во II класс криоконсервантов, наиболее выраженными хладозащитными свойствами обладают искусственный полимер поливи-нилпирролидон и растворы на его основе а также гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) и водные растворы на его основе.

Краткие сведения о поливинилпирроли-доне (ПВП). ПВП — продукт полимеризации N₁- винилпирролидона и ацетилена. Брутто-формула (C6H9NO)n. В СССР приоритет принадлежит С. Н. Ушакову с соавт. [3] и М. Ф. Шо-стаковскому с соавт. [4]. рН раствора около 7,0; не вызывает раздражения при подкожных, внутримышечных и внутривенных введениях. ЛД ₅₀ на мышах не установлена. При внутривенном введении 25 % раствора переносимая доза ПВП составила 8 г/кг массы тела, летальная — 12–15 г/кг. ПВП термоустойчив, хорошо переносит стерилизацию в автоклаве.Стерилизация ПВП озоном в концентрации 5 мг/л и больше вызывает разрушение химического вещества [5]. Водные растворы ПВП м. м. 12 000–25 000 являются фармакопейными препаратами и применяются в трансфузиологии в качестве плазмо-заменителей, обладающих дезинтоксикаци-онным действием. Примером может служить отечественный препарат Гемодез — 6 % ПВП с м. м. 12 000 ± 2700.

Препараты ПВП с м. м. от 30 000 до 40 000 и больше могут содержать примеси альдегидов, которые способны индуцировать перекисные процессы в клетках и оказывать на них токсическое действие. Согласно данным ряда авторов [6, 7], отмечены деструктивные изменения ретикулоэндотелиальных клеток селезенки, а также длительная задержка ПВП в печени, селезенке, бронхах костном мозге, почках, поджелудочной железе и других органах.Выведение растворов ПВП с м. м. 50 000 сопровождается образованием пристеночных тромбов и других осложнений.

Моноэкзоцеллюлярные криоконсерванты на основе ПВП для замораживания ГСК костного мозга при –78о÷-196оС.

Криопротекторные свойства ПВП достаточно полно изучены С. С. Лаврик [7, 8]. В том числе разработаны методы замораживания

ЯККМ под защитой 2 лекарственных форм .

Лекарственная форма № 1 включает : По-ливинилпирролидон с м. м. 12 600, 17 г; Глюкоза, 10,2 г; Сыворотка крови группы АВ(IV) 10 мл; Гепарин, 2500 МЕ; Бидистиллирован-ная вода — до 100 мл. Защитную среду готовят ex tempore перед консервированием ЯККМ. Утверждена МЗ УССР 22.07.1971 года.

Стерильный криоконсервант соединяют с концентратом ЯККМ 1:1. При этом конечная концентрация ПВП в полученной суспензии составляет 8,5 %. Суспезию клеток выдерживают при + 2оС– + 4оС в течение 20–30 мин затем замораживают по двухэтапной программе: на первом этапе со скоростью 1оС/ мин до –20оС, затем со скоростью 10оС/мин до –60оС, после чего переносят в сосуд с твердой углекислотой при –78оС на срок до 21 мес.Отогревание образцов ЯККМ производят в водяной ванне при + 38оС в течение 60–70 сек. При этом сохраняется 86±3,8 % жизнеспособных клеток. В случае помещения суспензии в жидкий азот (–196оС) на срок от 21 мес. до 10 лет сохраняется,соответственно до 90±2,4 % и 83,3±0,97 % эозинорезистентных клеток.

Лекарственная форма № 2 имеет следующий состав: Поливинилпирролидон с м. м. 12 600±2 700, 200 г; Глюкоза, 100 г; Аминокро-вин, 50 мл; Натриевая соль сахарной кислоты 20 г; Натрий фосфат трехзамещенный, 17 г Вода для инъекций — до 1000 мл. рН 3,8–4,0.

Стерилизуют через фильтры Millipore с диаметром пор 0,22 мкм и повторно автоклавированием при 105оС в течение 45 мин. Приготовленный раствор стерилен, непирогенен, нетоксичен. Хранят в сухом темном помещении при комнатной температуре до 2 лет. Смешивают с концентратом ЯККМ 1:1, эквилибрируют при комнатной температуре 30 мин, замораживают по 2 этапной программе: на первом этапе — со скоростью 0,8оС-1,5оС/мин до точки кристаллизации на втором — со скоростью 10оС/мин до –70оС после чего перекладывают в электроморозильник на –85о — –90оС на срок до 5 мес. При указанной технологии сохраняется 63,5 % жизнеспособных ЯККМ.

Метод консервирования ядерных клеток пуповинной крови при –80оС ÷ –196оС под защитой моноэкзоцеллюлярного криоконсерванта на основе ПВП.

Разработан П. М. Перехристенко с соавт. [9]. Изъятую пуповинную кровь тестируют по системам АВО, Резус, HLA, определяют иммунофенотип ГСК, подсчитывают число ядер-ных клеток и ГСК в 1 мкл взвеси,стабилизи-рованной 4:1 на гемоконсерванте Глюгицир. Состав гемоконсерванта Глюгицир: Натрий гидроцитрат для инъекций (ГФХ, стр.432), 20 г; Глюкоза (ГФХ, стр. 311), 30 г; Вода для инъекций (ГФХ, стр.74) до 1000 мл.

Стабилизированная кровь сохраняется при + 4±2оС в течение 48 час. Ядерные клетки выделяют из крови путем ее центрифугирования со скоростью 1200 об/мин в течение 15 мин. Плазму отсасывают, замораживают при –20о÷-30оС и сохраняют до размораживания ГСК и последующего ресуспендирования ГСК в ней.

Для криоконсервирования концентрата ядерных клеток с ГСК используют криоконсервирующий раствор , в который входят: Поливинилпирролидон низкомолекулярный медицинский (ФС 42–1194–78), 17- г; Глюкоза (ГФХ, стр. 311), 100 г; Лактоза (ГФХ, стр. 589), 40 г; Вода для инъекций (ГФХ, стр. 74) до 1000 мл.

Раствор разливают в стеклянные флаконы вместимостью 100 мл по 50 мл, автоклавируют при + 120±2оС и давлении пара 10,8*104Па (1,1 кгс/см2) в течение 30 мин.

В асептических условиях к клеточной массе приливают криоконсервант в соотношении 1:1, перемешивают, разливают в криоконтейнеры объемом 75 или 160 мл. Холодовую адаптацию ГСК проводят при + 4±2оС в течение 30–40 мин. Биоконтейнеры с клеточной суспензией замораживают по двухэтапной программе: на первом этапе со скоростью 1оС/мин до –6оС, на втором — 10оС/ мин до –80оС, после чего переносят в хранилище с жидким азотом (–196оС) для хранения на протяжении до 10 лет без снижения биологической полноценности ГСК. Размораживают в водяной ванне при + 40±5оС в течение 35±5 сек. В результате сохраняется не менее 80 % ядерных клеток.

Гидроксиэтилированный крахмал (ГЭК) — высокомолекулярное соединение, является продуктом реакций окиси этилена и амилопектина. Состоит из полимеризированных остатков глюкозы [10]. Оказалось, что концентрации 70 % ГЭК не подвергаются замораживанию. Изучение физиологического эффекта в эксперименте и клинике показало, что ГЭК является нетоксичным, биологически инертным с практически отсутствующей иммунологической активностью [6]. Этот полимер относится к числу экстрацеллюлярных криопротекторов и является в 14 % концентрации эффективным при криоконсервировании эритроцитов до –196^оС и быстром отогреве клеточной суспензии при 48^оС. Замораживание 385 мл крови таким способом обеспечивает сохранность до 98 % эритроцитов. Растворы 15 % ГЭК при замораживании ядерных клеток костного мозга по определенной программе позволяют сохранить высокое число жизнеспособных клеток.При комбинированном замораживании 4 % ГЭК с 5 % ДМСО гранулоци-товчеловекадо–80^оСсоскоростью2град/мин и отогрева сохраняется 95±2 % форменных элементов. ГЭК по криопротективной активности близок к ДМСО. В 1969 г. было впервые сообщено осохранности до 70 % тромбоцитов при использовани 6 % ГЭК [5].

В целом вопрос о широком применении растворов ПВП и ГЭК для замораживания клеток и тканей не может считаться окончательно решенным.До сих пор не определено место ГЭК в ряду известных веществ со свойствами криопротекторов. Так же не решены важные в клиническом плане проблемы с предупреждением многообразных аллергических и анафилактоидных реакций различной степени тяжести у реципиентов после инфузий криоконсервантов на базе ГЭК.Это требует дальнейших исследований в направлении изучения механизма действия полимеров на физико-химические свойства заморо-женно-отогретых клеток.