Циркулирующие FOXP3+ Т-лимфоциты при хронической ишемической болезни сердца: взаимосвязь с тяжестью атеросклероза и состоянием обмена липидов

Kologrivova I.V., Suslova T.E., Koshelskaya O.A., Kharitonova O.A., Trubacheva O.A., Kravchenko E.S. Circulating FoxP3+ T-lymphocytes in chronic coronary artery disease: Associations with the severity of atherosclerosis and lipid metabolism. The Siberian Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2021;36(2):45–51.

Т-регуляторные (Treg) лимфоциты обладают значительным иммунорегуляторным потенциалом в ходе развития атеросклероза. Показано сниженное содержание Тreg-лимфоцитов в нестабильных бляшках по сравнению c нормальной стенкой сосуда и со стабильными бляшками [1]. Искусственно индуцированный дефицит Тreg-лим-фоцитов в циркуляции ассоциировался с неэффективностью агрессивной липидснижающей терапии в отношении предотвращения прогрессии атеросклероза [2].

Транскрипционный фактор forkhead box protein P3 (FoxP3) является главным регулятором активности Тreg-лимфоцитов [3]. До недавнего времени внутриядерный маркер FoxP3 считался «золотым стандартом» определения Тreg. Однако вскоре были получены сведения о том, что конвенционные («нерегуляторные») Т-лимфоциты (Tconv) также экспрессируют FoxP3 на определенном этапе активации. Но в Тconv-клетках FoxP3 преимущественно локализовался в ядре и не приводил к индукции иммуносупрессорной активности клеток, характерной для Тreg-лимфоцитов [3].

Ранее мы показали, что иммунорегуляторный дисбаланс при нарушениях углеводного обмена и развитии диастолической дисфункции проявляется, в том числе в снижении содержания циркулирующих FoxP3+ Treg-лимфоцитов [4]. Однако содержание Тreg-клеток в периферической крови не всегда отражает тяжесть развития атеросклероза, что затрудняет трансляцию экспериментальных данных в клинику [5]. В то же время новые технологии, доступные в современной проточной цитометрии, позволяют оценивать субклеточную локализацию внутриклеточных маркеров, которая зачастую является более чувствительной к воздействию различных патогенетических факторов. Данные об особенностях конвенционных FoxP3+ Т-лимфоцитов при стабильной ишемической болезни сердца (ИБС) и о субклеточной локализации FoxP3 в конвенционных и регуляторных лимфоцитах в доступной литературе на сегодняшний день отсутствуют.

Появляется все больше доказательств в пользу тесной взаимосвязи между липидным обменом и Тreg-лим-фоцитами [6]. Учитывая липидную природу нарушений, лежащих в основе атерогенеза, изучение взаимодействия между FoxP3+ клетками и показателями липидного обмена приобретает особую актуальность. В последнее время внимание мирового сообщества привлекает про-протеиновая конвертаза субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9), которая является ферментом, опосредующим деградацию рецепторов к холестеролу липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛНП) [7]. Сортилин представляет собой внутриклеточный высокоаффинный рецептор PCSK9 и оказывает влияние на ее секрецию клетками печени [8]. Сведения о вкладе данных маркеров липидного обмена в иммунологическую регуляцию у пациентов с атеросклерозом являются крайне немногочисленными и зачастую противоречивыми.

Цель исследования: изучение количественного содержания и качественных характеристик FoxP3+ Tconv и Тreg-лимфоцитов и их взаимосвязи с показателями липидного обмена у пациентов c хронической ИБС в зависимости от тяжести коронарного атеросклероза.

Материал и методы

В исследование вошли 14 пациентов с документированной хронической ИБС, госпитализированных в клинику НИИ кардиологии Томского НИМЦ. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом и составлен в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Все пациенты дали информированное согласие на участие в исследовании. Критериями исключения являлись перенесенное менее 6 мес. назад острое сосудистое осложнение или аортокоронарное шунтирование, развитие или обострение воспалительных заболеваний, тяжелая сопутствующая патология (печеночная, почечная недостаточность, онкологические заболевания), отказ от участия в исследовании. Всем пациентам проводилась ангиография на ангиографическом комплексе Artis one и Digitron-3NAC компьютерной системе (Siemens Shenzhen Magnetic Resonance Ltd., Shenzhen, China). Тяжесть атеросклероза оценивалась путем расчета индекса Gensini Score (GS) [9]. Медиана GS в общей выборке пациентов составила 20 баллов. Пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от значений GS: в 1-ю группу вошли пациенты с GS < 20 баллов, во 2-ю группу – с GS ≥ 20 баллов (табл. 1).

Содержание FoxP3+ Тreg- и Tconv-лимфоцитов оценивали методом проточной цитометрии с визуализацией (прибор Amnis FlowSight, Luminex, США) во фракции мононуклеарных лейкоцитов, полученных из гепаринизированной крови методом центрифугирования на градиенте плотности Histopaque 1077, Sigma Aldrich, USA). Для фенотипирования клеток использовали моноклональные антитела FITC-анти-CD4, APC-анти-CD25, PE-анти-FoxP3 и 7-амино-актиномицин Д для окрашивания ядра (7-AAD) (BD eBiosciences, USA). Клетки с фенотипом CD4+FoxP3+CD25high являлись Treg-лимфоцитами; клетки с фенотипом CD4+FoxP3+CD25lo – Tconv-лимфоцитами. Для обработки данных использовали программное обеспечение INSPIRE и IDEAS 6.2 (Amnis, Luminex). Для оценки уровня ядерной локализации FoxP3 применяли мастер обработки изображений Nuclear Localization Wizzard. Рассчитывали относительное и абсолютное количество клеток, используя результаты общего анализа крови.

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ STATISTICA 10.0 (StatSoft Inc., США). Для описания признаков с отличным от нормального распределением использовали медиану и межквартильный интервал. Различия числовых характеристик в двух независимых группах пациентов выявляли с помощью критерия Манна – Уитни. Для сравнения качественных и полуколичественных признаков применяли точный критерий Фишера. Ранговый коэффициент корреляции Спирмена ( r_s ) использовали для оценки взаимосвязи между признаками. Результаты статистического анализа считали статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Таблица 1 . Характеристика пациентов, включенных в исследование Table 1. Characteristics of recruited patients

Параметры Parameters	Пациенты с GS < 20 баллов, n = 6 Patients with GS < 20, n = 6	Пациенты с GS ≥ 20 баллов, n = 8 Patients with GS ≥ 20, n = 8	p
Пол (мужчины/женщины) Sex (men/women)	2/4	6/2	0,277
Возраст, лет Age, years	68,0 (66,0; 69,0)	58,0 (50,0; 68,0)	0,108
Пациенты с инфарктом миокарда в анамнезе, n (%) Patients with history of myocardial infarction, n (%)	1 (17)	3 (38)	0,580
Пациенты с артериальной гипертонией, n (%) Patients with hypertension, n (%)	6 (100)	8 (100)	–
Длительность артериальной гипертонии, лет Hypertension duration, years	19,5 (15,0; 20,0)	17,5 (11,0; 35,0)	0,987
Пациенты с сахарным диабетом 2-го типа , n (%) Patients with type 2 diabetes mellitus, n (%)	3 (50)	4 (50)	0,998
Длительность сахарного диабета 2-го типа, лет Duration of diabetes mellitus type 2, years	0,5 (0; 3,0)	1,5 (0; 7,0)	0,573
Систолическое артериальное давление, мм рт. ст. Systolic blood pressure, mmHg	124,0 (108,5; 139,5)	138,0 (124,0; 150,0)	0,228
Диастолическое артериальное давление, мм рт. ст. Diastolic blood pressure, mmHg	71,0 (61,5; 82,0)	77,5 (65,0; 78,0)	0,755
Пациенты-курильщики, n (%) Smokers, n (%)	1 (17)	2 (25)	0,998
Терапия статинами, n (%) Statin therapy, n (%)	6 (100)	8 (100)	–
Индекс массы тела, кг/м2 Body mass index, kg/m2	28,8 (25,7; 32,0)	29,7 (24,4; 32,5)	0,950
Окружность талии, см Waist circumference, cm	96,0 (93,0; 97,0)	104,0 (98,0; 110,5)	0,284
Индекс Gensini Score, баллы Gensini Score index, points	15,5 (0; 17,5)	44,0 (36,0; 101,3)	0,001

Результаты

Пациенты 1-й и 2-й групп не различались по относительному и абсолютному содержанию FoxP3+ Тreg- и Тconv-лимфоцитов, а также по доле Т-лимфоцитов с ядерной локализацией FoxP3 в зависимости от величи- ны GS. Однако в группе пациентов с GS > 20 баллов мы обнаружили более низкую интенсивность флуоресценции нуклеарного FoxP3 в Тreg-лимфоцитах и статистически значимое снижение интенсивности флуоресценции FoxP3 в ядре Тconv-лимфоцитов (табл. 2).

Таблица 2. FoxP3+ субпопуляции Т-регуляторных и Т-конвенционных лимфоцитов у пациентов с хронической ишемической болезнью сердца в зависимости от величины индекса Gensini Score

Table 2. FoxP3+ subpopulations of T-regulatory and T-conventional lymphocytes in patients with chronic coronary artery disease depending on the Gensini Score values

Параметры Parameters	Пациенты с GS < 20 баллов, n = 6 Patients with GS < 20, n = 6	Пациенты с GS ≥ 20 баллов, n = 8 Patients with GS ≥ 20, n = 8	p
Относительное содержание FoxP3+ Treg, % FoxP3+ Treg frequency, %	7,94 (6,20; 9,54)	6,66 (6,20; 7,75)	0,414
Абсолютное содержание FoxP3+ Treg, ×107/л FoxP3+ Treg absolute counts, ×107/L	7,56 (5,61; 8,47)	7,79 (3,85; 11,41)	0,973
Относительное содержание FoxP3+ Tconv, % FoxP3+ Tconv frequency, %	1,53 (1,19; 1,77)	1,59 (1,45; 1,94)	0,755
Абсолютное содержание FoxP3+ Tconv, ×107/л FoxP3+ Tconv, absolute counts, ×107/L	1,51 (0,69; 1,60)	1,53 (0,79; 2,65)	0,662
Частота Treg-клеток с ядерной локализацией FoxP3, % Frequency of Tregs with FoxP3 nuclear localization, %	98,40 (96,80; 99,10)	98,20 (93,70; 98,60)	0,662
Абсолютное содержание Treg-клеток с ядерной локализацией FoxP3, ×107/л Absolute counts of Tregs with FoxP3 nuclear localization, ×107/L	6,86 (5,43; 8,31)	7,70 (3,63; 11,24)	0,852
FoxP3 Bright Detail Intensity в ядре Treg FoxP3 Bright Detail Intensity in Treg nucleus	32,50 (18,80; 40,60)	2,45 (1,05; 4,22)	0,181
Частота Tconv-клеток с ядерной локализацией FoxP3, % Frequency of Tconv with FoxP3 nuclear localization, %	85,85 (83,00; 90,30)	96,05 (53,80; 98,10)	0,491
Абсолютное содержание Tconv-клеток с ядерной локализацией FoxP3, ×107/л Absolute counts of Tconv with FoxP3 nuclear localization, ×107/L	0,93 (0,57; 1,33)	1,27 (0,52; 2,59)	0,491
FoxP3 Bright Detail Intensity в ядре Tconv FoxP3 Bright Detail Intensity in Tconv nucleus	10,04 (4,71; 14,90)	6,06 (4,64; 11,65)	0,029

Показатели углеводного и липидного обменов были сопоставимы в группах пациентов с различным уровнем GS, за исключением содержания ХС-ЛВП, которое было ниже у пациентов с GS > 20 баллов (табл. 3).

В результате корреляционного анализа мы выявили тенденцию к существованию обратной взаимосвязи между количеством Тreg-клеток с ядерной локализацией FoxP3 и индексом GS (rs = –0,681) только в группе паци- ентов с GS > 20 баллов. В общей выборке пациентов со стабильной ИБС индекс GS имел тенденцию к обратной взаимосвязи с интенсивностью флуоресценции FoxP3 в ядрах Treg-лимфоцитов (rs = –0,476) и Tconv-лимфоцитов (rs = –0,526). Количественные и качественные показатели FoxP3+ Treg и FoxP3+ Tconv-лимфоцитов характеризовались наличием многочисленных корреляционных взаимосвязей с параметрами липидного обмена (табл. 4).

Таблица 3. Метаболические параметры у пациентов с хронической ишемической болезнью сердца в зависимости от величины индекса Gensini Score

Table 3. Metabolic parameters in patients with chronic CAD depending on the Gensini Score index values

Параметры Parameters	Пациенты с GS < 20 баллов, n = 6 Patients with GS < 20, n = 6	Пациенты с GS ≥ 20 баллов, n = 8 Patients with GS ≥ 20, n = 8	p
Глюкоза, мМ Glucose, mM	5,78 (5,25; 6,00)	6,71 (5,69; 7,36)	0,181
Гликированный гемоглобин, % Glycated hemoglobin, %	6,07 (5,81; 8,40)	6,35 (5,67; 8,28)	0,931
Инсулин, мкМЕ/мл Insulin, μIU/mL	5,91 (5,70; 8,31)	4,19 (3,73; 5,44)	0,177
ОХС, мМ TC, mM	3,10 (2,94; 4,61)	3,73 (3,32; 4,32)	0,491
ТГ, мМ TG, mM	1,05 (0,70; 1,95)	1,52 (1,21; 2,02)	0,345
ХС-ЛВП, мМ HDL-C, mM	1,40 (1,23; 1,68)	1,06 (0,98; 1,23)	0,029
ХС-ЛНП, мМ LDL-C, mM	1,38 (1,06; 2,50)	1,94 (1,58; 2,49)	0,345
ТГ/ХС-ЛВП TG/HDL-C	0, 82 (0,56; 1,34)	1,47 (0,96; 1,93)	0,059
ХС-ЛНП/ХС-ЛВП LDL-C/HDL/C	1,10 (0,86; 1,49)	1,88 (1,29; 2,49)	0,108
Аполипопротеин В, мг/дл Apolipoprotein B, mg/dL	63,81 (61,20; 83,25)	91,73 (80,50; 160,85)	0,247
Аполипопротеин А1, мг/дл Apolipoprotein A1, mg/dL	191,03 (177,18; 207,65)	182,03 (142,57; 194,27)	0,329
PCSK-9, нг/мл PCSK-9, ng/mL	188,40 (170,00; 208,20)	233,95 (174,30; 287,50)	0,352
Сортилин, нг/мл Sortilin, ng/mL	10,71 (4,57; 167,23)	59,24 (5,76; 113,54)	0,993

Таблица 4. Корреляционные взаимосвязи между метаболическими показателями и параметрами FoxP3+ лимфоцитов

Table 4. Correlations between metabolic parameters and parameters of FoxP3+ lymphocytes

Параметры Parameters	r s
	FoxP3+ Tconv, %	FoxP3+ Treg, ×107/л (×107/L)	FoxP3+ Tconv, ×107/л (×107/L)	Treg с ядерной локализацией FoxP3, % Treg with nuclear FoxP3, %	Treg с ядерной локализацией FoxP3, ×107/л Treg with nuclear FoxP3, ×107/L	Tconv с ядерной локализацией FoxP3, ×107/л Tconv with nuclear FoxP3, ×107/L	FoxP3 Bright Detail Intensity Treg
ТГ/ХС-ЛВП TG/HDL-C	–	–	–	–	–	–	–0,578
PCSK9 PCSK9	–0,552	–	–0,709	–	–	–0,648	–
Аполипопротеин B Apolipoprotein B	–	0,727	0,573	–	0,709	–	–
Сортилин Sortilin	–0,552	–	–	0,689	–	–	–

Обсуждение

О важной роли транскрипционного фактора FoxP3 в работе Тreg- лимфоцитов и поддержании иммунорегуля-торного гомеостаза свидетельствуют тяжелые аутоиммунные патологии, которые развиваются при его мутации [10]. Функциональная активность FoxP3 регулируется на уровне эпигенетических модификаций, транскрипции, взаимодействия с микро-РНК, а также на уровне посттрансляционных процессов, заключающихся в убиквитинировании, ацети- лировании и фосфорилировании различных аминокислотных остатков FoxP3. Именно изменения на посттрансляционном уровне могут рассматриваться в качестве ключевого фактора, опосредующего изменение субклеточной локализации FoxP3 [10]. Имеются данные о том, что точная локализация внутри ядра также отражает функциональную активность FoxP3: в центре ядра он находится в активированном состоянии, в то время как локализация на периферии ассоциируется с его инактивацией [11].

В нашей работе единственным параметром, отличающимся у пациентов с более выраженным атеросклерозом, была сниженная интенсивность флуоресценции FoxP3 в ядре. Данный феномен косвенно свидетельствует о меньшем содержании транскрипционного фактора FoxP3 в ядре каждой отдельной клетки. Причем мы выявили изменения именно в ядрах конвенционных FoxP3 Т-лимфоцитов. Сведений о содержании и эффектах FoxP3+ Тconv-лимфоцитов при атеросклерозе в доступной литературе мы не обнаружили, тогда как широко обсуждается высокая пластичность Тreg клеток, которые способны терять иммуносупрессорные свойства и трансформироваться в провоспалительные Т-лимфоциты под влиянием IL-6 и IL-1β-опосредованного сигналинга [10]. Вероятно, хроническое воспаление при атеросклерозе ассоциируется со сниженной экспрессией и повышенной деградацией FoxP3 в Тreg-лимфоцитах [12].

Исходя из полученных нами данных корреляционного анализа, наиболее перспективными модуляторами активности FoxP3+ клеток можно рассматривать соотношение ТГ/ХС-ЛВП, апо-В, PCSK9 и сортилин. Нарушения липидного спектра являются критическими для поддержания жизнеспособности Тreg-лимфоцитов. Так, C.M. Rueda и соавт. (2017) установили, что ЛВП выступают в роли антиапоптотического фактора Тreg, в то время как на наивные CD4+ лимфоциты и Т-клетки памяти ЛВП не влияют [6]. Снижение внутриклеточного транспорта триглицеридов в Тreg-лимфоциты, напротив, оказывает положительное влияние на рекрутинг и аккумуляцию этих клеток в очагах хронического воспаления [13].

Мы выявили прямую взаимосвязь между содержанием апо-В и абсолютным количеством регуляторных и конвенционных FoxP3+ Т-лимфоцитов. Апо-В является одним из доказанных эпитопов, вызывающих активацию Т-клеток в ходе атерогенеза. Наличие в пуле Т-лимфоцитов апо-В-специфичных эффекторных клеток свойственно для пациентов с атеросклеротическим поражением сосудов, в то время как у здоровых людей выявляются исключительно апо-В-специфичные Тreg [14].

PCSK9 способна оказывать провоспалительные эффекты не только за счет увеличения содержания холе-стерола, но и за счет прямого взаимодействия с клет- ками иммунной системы. In vitro PCSK9 увеличивала продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами и синовиоцитами. Пациенты с ремиссией ревматоидного артрита характеризовались меньшим содержанием сывороточной PCSK9 по сравнению с пациентами, у которых ремиссия не была достигнута [15]. Согласно нашим данным, PCSK9 также может вносить вклад в поляризацию Treg в сторону конвенционных лимфоцитов, поскольку ее уровень в сыворотке отрицательно коррелировал с количеством FoxP3+ Тconv-лим-фоцитов и уровнем в них ядерной локализации FoxP3.

Сортилин вовлечен в секрецию PCSK9 [16]. В то же время деплеция Тreg-лимфоцитов ассоциировалась со снижением продукции сортилина в печени [13]. Несмотря на то, что наши данные и результаты, полученные другими исследователями, однозначно свидетельствуют о вовлеченности сортилина в регуляцию метаболизма и воспаления, требуются дальнейшие исследования для выяснения его непосредственной роли в этих процессах. Кроме того, сведения о вкладе сортилина в формирование атеросклеротической бляшки также являются противоречивыми [14]. Среди пациентов, включенных в наше исследование, уровни сортилина характеризовались высокой вариабельностью и не зависели от тяжести атеросклеротического поражения коронарных артерий.

Заключение

Таким образом, интенсивность флуоресценции FoxP3 в ядре Т-конвенционных лимфоцитов является более чувствительным маркером иммунорегуляторного дисбаланса при хронической ИБС по сравнению с количественным содержанием FoxP3+ Т-клеток в циркулирующей крови, которое остается практически неизменным по мере нарастания выраженности атеросклероза. При этом маркеры метаболизма липидов находятся в тесной взаимосвязи как с количественными, так и с качественными параметрами FoxP3+ Т-лимфоцитов. Целесообразно применение методов углубленного молекулярно-генетического анализа для изучения транскрипционных характеристик транскрипционного фактора FoxP3 при атеросклерозе.