Цитофлуориметрическая оценка популяционного спектра иммунных клеток крови и слюны у здоровых молодых людей

Введение. В настоящее время метод проточной цитофлуориметрии является общепринятым для определения популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов крови. До сих пор этот метод не применялся для оценки спектра иммуноцитов слюны. Особенностью современных аппаратных методов иммунологического анализа является их высокая специфичность и чувствительность, возможность регистрации большого числа событий, что позволяет анализировать состав клеток при небольшом их количестве в единице объема изучаемой биологической жидкости [4].

Авторами данной публикации разработан метод определения спектра иммунных клеток слюны (номер патентной заявки 2008120724, приоритет от 23.05.08).

Целью настоящего исследования было цито-флуориметрическое определение популяционного спектра иммунных клеток крови и слюны у молодых лиц, проживающих на Южном Урале.

Материалы и методы исследования. Всего в исследование включено 42 здоровых человека в возрасте от 18 до 30 лет. Средний возраст обследуемых 20,5 года, женщин было 13 человек, мужчин 29. У 11 человек определяли популяционный спектр лимфоцитов крови. Мужчин в группе было 4 и женщин 7 человек, средний возраст составил 20 лет.

Критериями включения служили:

• -    постоянное проживание в регионе Южного Урала;

• -    возраст от 18 до 21 лет;

• -    отсутствие острых или обострений хронических заболеваний;

• -    отсутствие иммунопатологии;

• -    отсутствие заболеваний слизистой оболочки ротовой полости.

Критерий исключения:

• -    несанированные заболевания зубов.

Осмотр ротовой полости стоматологом проводился непосредственно перед взятием исследуемого материала. Слюну забирали у здоровых лиц в соответствии с критериями включения и исключения, принятыми в данной работе. Забор слюны проводили утром натощак, через 10 минут после полоскания ротовой полости водой в сухие пластиковые флаконы без стимуляции слюноотделения. Кровь для анализа популяционного состава лимфоцитов забирали из вены утром натощак.

Иммунологические методы исследования:

Определение спектра лимфоцитов крови проводили по стандартной методике на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II с набором моноклональных антител той же фирмы. Подготовка исследуемой слюны и определение клеточного состава иммуноцитов с помощью проточного цитофлуорометра «BD FACSCanto II» проводилось по методике, разработанной С.Н. Тепловой, С.А. Ко-ченгиной, Э.Х. Рахматуллиной и др. (2008). Характерной чертой клеточного состава слюны является присутствие в ней не только иммунных клеток, но и эпителиоцитов. Для отличия иммунных клеток от эпителиоцитов использовали линейный дифференцировочный CD45+ маркер. Другой особенностью клеточного состава слюны является присутствие в ней большого числа нежизнеспособных клеток и клеточного детрита, что требует специальной подготовки проб с помощью отмывочной технологии с использованием специальной среды (RPMI с бикарбонатом).

Определение популяционного спектра жизнеспособных иммуноцитов в слюне, экспрессирующих линейный CD45+ мембранный антиген, проводили на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto IL Для оценки жизнеспособности клеток использовали витальный краситель 7-AAD. Для анализа CD-маркеров применяли моноклональные антитела фирмы Becton Dickinson, серии MultiTest с использованием четырех меток следующими флуоресцентными красителями: Fluorescein izotyocyanat (FITC), Phycoerytrin (PE), Perpidin chlorofhyll protein (PerCP), Allophycocyanin (APC). Использовался оптимизированный лизирующий раствор той же фирмы в рабочем разведении. Во всех случаях проводилась постановка негативного изотипического контроля [6].

Число жизнеспособных клеток, экспрессирующих общелейкоцитарный линейно-ассоциированный дифференцировочный антиген CD45+, определяли с помощью метки CD45APC и красителя 7-AAD. Среди популяций иммуноцитов подсчитывали: гранулоциты (CD45+CD13+CD143, моноциты (CD45+ CD14+ CD 133, Т-цитотоксические лимфоциты (CD45+CD3+CD83, Т-хелперы (CD45+CD33, NK-клетки (CD45+CD 5б+ 1бЗ [5].

Статистическая обработка проведена применением программного комплекса Statistica for Windows версия 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США). В таблицах представлены данные в виде средней арифметической (М), доверительного интервала (195) универсальной средней - медианы (Me) и межквартильного интервала (Q25-Q75).

Результаты и обсуждение. Полученные результаты определения основных популяций лимфоцитов крови у обследуемых здоровых молодых лиц, проживающих на Южном Урале, представлены в табл. 1, в которой приведены общее число наблюдений (п), средняя арифметическая (М) и ний этих показателей во всех случаях перекрывают друг друга [1].

Нами впервые разработан и использован метод цитофлуориметрической оценки иммуноцитов слюны.

Клеточный состав слюны: иммуноциты (СО45+), эпителиальные и другие клетки (CD453, клеточный детрит (дебрис)

Рисунок демонстрирует результат цитофлуо-риметрического определения всей совокупности клеток слюны. Как следует из рисунка, в ротовой полости обнаруживаются в максимальном количестве CD45" клетки, к которым относятся в основном эпителиоциты. В большом количестве в слюне представлены клетки, экспрессирующие линейный дифференцировочный маркер CD45+, включающие все иммуноциты: гранулоциты, макрофаги, популяции лимфоцитов. Достаточно большую область на графике занимает клеточный дебрис, т.е. фрагменты разрушенных клеток ротовой полости.

.                        Таблица 1

Результаты цитофлюориметричекого определения спектра лимфоцитов крови у молодых людей, проживающих на Урале

Показатель n м I95 Me Q25-Q75 CD3 % И 74 68,5-77,3 72,7 69,6-78,1 CD4 % И 43 37,2-48,3 47,4 37,4^19,4 CD8 % 11 28 19,3-47,8 26,2 23,15-35,5 CD4/CD8 11 1,6 1,22-2,12 2,0 1,1-2,0 CD19 % 11 11 9,3-13,9 10,95 9,48-14,3 CD( 16+56+) % И 12 7,87-16,7 11,3 7,2-17,7 интервал достоверности (195), а также медиана (Me) и интерквартильный размах (Q25-Q75)-

Далее для сопоставления полученных данных с результатами других авторов в табл. 2 приведены материалы цитофлюориметрического определения спектра лимфоцитов крови, опубликованные разными исследователями из разных регионов, вместе с полученными нами показателями.

Как следует из табл. 2, процентное содержание основных популяций лимфоцитов крови (CD3, CD4, CD8, CD19, CD16/56) при цитофлуоримет-рическом определении, по данным разных лабораторий, практически совпадает, интервалы колеба-

Далее в слюне было определено число жизнеспособных CD45+ клеток (табл. 3) с помощью красителя 7-AAD.

Средние показатели численности популяций жизнеспособных иммуноцитов в слюне (средняя арифметическая и интервал достоверности, а также медиана и квартильный размах), у 42 молодых людей, которые были определены с помощью проточной цитофлуориметрии, приведены в табл. 3. Среди жизнеспособных CD45+ клеток преобладающими в слюне здоровых молодых людей были популяции лейкоцитов, экспрессирующих маркеры гранулоцитов (CD45+CD13+), количество кото-

Проблемы здравоохранения

Таблица 2 Сопоставление результатов цитофлюориметричекого определения спектра иммунных клеток крови у молодых людей Южно-Уральского региона с результатами других исследователей

Показатель Интервал колебаний показателей Интервал колебаний показателей Интервал колебаний показателей Интервал колебаний показателей CD3% 56-86 60-80 59-85 63-82 CD4% 33-58 33-50 29-57 29-53 CD8% 13-39 16-39 11-38 18-43 CD4/CD8 1,4-2,5 1,2-2,0 1,5-2,6 1,22-2,12 CD19% 5-22 5-22 6,4-23 7-18 CD (16+56) % 5-26 — 5,6-31 5-22 CD16% — 3-20 — — CD56% — 5-25 — — Литературный источник Laurence J., et al., 1993 [8] Лутонская С.А. и др., 2005 [2] Kretowski А., et al., 1999 [7] Данные настоящего исследования рых было равно 80,95 %. Достаточно представительной была популяция макрофагов (CD45+ CD 14*), медиана которой составила 20,65 % от жизнеспособных иммуноцитов. Минимальной была доля лимфоцитов в слюне, процент которых составлял 0,8 от общего количества жизнеспособных CD45+клеток.

Распределение субпопуляций лимфоцитов оценивалось в пределах общей популяции жизнеспособных лимфоцитов, число которых принималось за 100 %. Оказалось, что доля Т - лимфоцитов (CD45+ CD34) в слюне составила 19,5 %, Т хелперов (CD45+CD4+) - 19,7 %, Т цитотоксических клеток (CD45+CD84) - 0,65 %. Соотношение Т - хелперов и Т - цитотоксических клеток было равным 30,3. Число В-лимфоцитов (CD45+CD19+) равным 2,01 % [3].

В целом, общая закономерность распределения лимфоцитов в слюне напоминает распределение соответствующих субпопуляций в крови: максимально в изучаемой биологической жидкости представлены Т лимфоциты, из них Т хелперы и в меньшей степени Т цитотоксические клетки и В лимфоциты. Особенностью популяционного состава лимфоцитов слюны является более низкое содержание Т клеток и Т хелперов, чем в крови, очень низкое количество Т цитотоксических лимфоцитов и соответственно высокий иммунорегу-ляторный индекс - соотношение CD4/CD8 клеток, достигающий 30,3.

Таким образом, в настоящее время в иммунологии стандартным методом оценки системного

Таблица 3

Спектр иммунных клеток слюны у молодых людей, проживающих на Южном Урале (п = 42)

.     Показатель М I95 Me (Q25-Q75) Число жизнеспособных CD45+ клеток в % от общего числа клеток слюны 49,3 37,4-61,2 48,2 38,7-58,7 CD45 +CD13+ в % от общего числа жизнеспособных CD45+ клеток слюны 74,41 52,00-95,00 80,95 61,00-93,10 CD45 +CD14 +в % от общего числа жизнеспособных CD45+ клеток слюны 20,3 9,6-40,0 20,3 19,1-21,0 Число лимфоцитов в % от общего числа жизнеспособных CD45+ клеток слюны 0,8 0,2-3,6 0,6 0,2-1,3 CD45 + CD3+ в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 17,8 17,6-20,0 19,5 19,2-19,7 CD45 +CD4+ в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 15,6 13,2-20,0 19,7 17,4-19,8 CD45 +CD8 +в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 1Д 0,50-2,20 0,65 0,08-1,48 CD4/CD8 в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 13,9 9,0-26,4 30,3 13,3-217,5 CD45 +CD19 + в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 2,2 1,0-4,0 2,0 1,5-2,4 CD45+ CD(16+56+) в % от общего числа CD45+ жизнеспособных клеток слюны 5,6 1,4-14,6 1,8 1,1-11,5 иммунитета является определение показателей крови, для чего используются самые современные технологии, включая метод проточной цитофлуо-риметрии для анализа популяционного состава лимфоцитов крови [9]. Этот метод до сих пор не нашел широкого применения для оценки спектра иммуноцитов других биологических жидкостей организма, в частности для анализа клеточного состава слюны. В то же время изучение особенностей мукозального иммунитета, содержания иммуноцитов в секретах, омывающих слизистые оболочки, которые являются основными входными воротами для поступления различных микробных агентов в организм, представляет теоретический и практический интерес, т.к. имеются топические особенности ответа мукозоассоциированной лимфоидной ткани на различные антигены. Изучение этих особенностей делает необходимым разработку аппаратных методов анализа клеточного и молекулярного состава различных биологических жидкостей. В данной статье приведено содержание иммуноцитов в крови и в слюне молодых людей, проживающих на Южном Урале, по материалам проточной цитофлуориметрии слюны, что можно использовать в качестве норм для оценки иммунных параметров слюны.