Цитогенетические исследования в международной программе ВОЗ по изучению медицинских последствий аварии на Чернобыльской АЭС

World Health Organization, Geneva, Switzerland

The paper presents a review of main approaches related to use of cytogenetic methods in biomedical studies, in particular, in progammes and projects of WHO for investigation of medical consequences of the Chernobyl accident. The paper stresses the contribution of prominent radiobiologist and geneticist N.V.Luchnik to development of the theory and practice of chromosome aberrations analysis.

Радиационная цитогенетика , одним из ярких представителей которой является Н . В . Лучник , внесла значительный вклад в развитие радиобио логии и радиационной медицины . Этот вклад осо бенно ощутим в разработке следующих научных направлений , нацеленных на изучение биологиче ских эффектов радиации [1] и прикладного ис пользования достижений радиационной цитогене тики :

• 1.    Теоретическая радиобиология :

• -    природа кривых доза - эффект ;

• -    эффекты мощности дозы и фракциониро вания дозы ;

• -    эффекты линейной передачи энергии .

• 2.    Понимание роли хромосомных аберраций в механизме развития следующих радиобиологичес ких эффектов :

• -    гибель клеток ;

• -    мутации ;

• -    канцерогенез .

• 3.    Изучение цитогенетических радиобиологи ческих эффектов на молекулярном уровне .

• 4.    Биологическая дозиметрия и реконструкция доз .

• 5.    Оптимизация лучевой терапии .

• 6.    Развитие новых технологий для цитогене тического анализа .

ВОЗ, будучи международным учреждением, призванным, в первую очередь, оказывать практическую помощь национальным органам здравоохранения в улучшении здоровья населения и уменьшении медицинских последствий техногенных и естественных катастроф, основное внимание уделяет возможности прикладного использования научных достижений. Применительно к проблеме изучения влияния на здоровье людей радиационного облучения вследствие аварии в Чернобыле ВОЗ придает большое значение возмож- ности использования методов биологической дозиметрии, включая и те, которые основаны на изучении хромосомных аберраций, для реконструкции индивидуальных доз у лиц, подвергшихся радиационному воздействию. Вместе с тем, преследуя практические цели, ВОЗ не упускает возможности расширить и научное знание. Такой подход в полной мере проявляется в Международной программе ВОЗ по уменьшению медицинских последствий чернобыльской аварии. Эта программа широко известна под названием АЙФЕКА (английское произношение сокращенного названия программы - IPHECA - International Programme on the Health Effects of the Chernobyl Accident).

АЙФЕКА была инициирована ВОЗ в мае 1991 года . Первая , экспериментальная или пилотная , фаза этой программы , которая выполнялась ВОЗ совместно с Министерствами здравоохранения и профильными институтами Белоруссии , России и Украины , практически завершилась к концу 1994 года . Она включала 5 проектов , направленных на раннее выявление рака щитовидной железы у де тей , облученных в результате аварии ( проект “ Щи товидная железа ”), лейкозов у жителей загряз ненных радионуклидами территорий ( проект “ Ге матология ”), повреждений головного мозга у де тей , облученных in utero ( проект “ Повреждение головного мозга in utero”), стоматологических за болеваний у населения Белоруссии , под вергшегося воздействию радиации ( проект “ Сто матология ”). Еще один проект (“ Эпидемиоло гический регистр ”) предусматривал оказание по мощи Национальным чернобыльским регистрам в сборе , хранении , передаче и анализе эпи демиологической информации в пострадавших от аварии районах .

Важность дозиметрических исследований и ре конструкции индивидуальных доз у пациентов с лейкозом или раком щитовидной железы , а также коллективных доз у жителей загрязненных терри торий была признана с самого начала выполнения программы АЙФЕКА . В период пилотной фазы программы эти исследования проводились в рам ках " поддерживающей активности ", целью которой являлись сбор и верификация данных о дозах на щитовидную железу , реконструкция индивидуаль ных доз внутреннего и внешнего облучения , рет роспективная оценка доз облучения всего тела .

Результаты выполнения первой фазы програ ммы АЙФЕКА были опубликованы ВОЗ в 1995 году в виде обобщающего доклада , предназначенного для широкой аудитории [2], ив 1996 году как науч ный доклад для ученых и специалистов [3].

Одним из подходов в решении задач биологической дозиметрии, которые использовались на пилотной фазе АЙФЕКА, являлось изучение нестабильных и стабильных хромосомных аберраций у пострадавшего от аварии населения. Проведение таких исследований базировалось на предшествующем знании о возможности использования метода изучения хромосомных аберраций для оценки дозы облучения. Впервые такой подход был использован Bender и Gooch [4] для оценки дозы облучения у трех пострадавших от аварии в Hanford, USA. Возможности хромосомной дозиметрии расширились с внедрением метода FISH (fluorescence in situ hybridization), позволяющим ускорить счет и повысить точность определения симметричных транслокаций и вставок (insertions). Значительный вклад в развитие биологической дозиметрии по изучению хромосомных аберраций внесли работы Н.В. Лучника. При этом особую ценность в плане приложения к чернобыльской ситуации приобретают его исследования по эффектам малых доз радиации на хромосомы. Водной из работ Н.В.Лучника, опубликованной в 1983 году [5], отмечено, что дозы радиации в диапазоне 0,1-0,3 Гр вызывают более выраженный эффект, регистрируемый по аберрациям хромосом в лимфоцитах человека, чем это можно было предвидеть, экстраполируя на этот диапазон доз результаты, полученные при умеренных дозах. Механизм такого аномального эффекта радиации в диапазоне малых доз Н.В.Лучник связал с возможной индукцией и/или ингибицией процесса репарации под влиянием радиации. Таким образом, были все предпосылки к включению в программу АЙФЕКА цитогенетических исследований с тем, чтобы используя предшествующий опыт, получить новое знание о "хромосомной " дозиметрии в диапазоне малых доз.

С целью оказания помощи радиационным ци тогенетикам Белоруссии , России и Украины в про ведении цитогенетических исследований ВОЗ за купил и направил в три страны специальное обо рудование ( таблица ). Кроме того , ВОЗ оказал фи нансовую поддержку участникам исследований в изучении новых цитогенетических методов в ве дущих зарубежных лабораториях .

Цитогенетические исследования для целей биологической дозиметрии проводились А.В.Се-ванькаевым с сотрудниками в рамках пилотной фазы АЙФЕКА в 1992-1993 гг. Результаты этих исследований включены в Научный отчет ВОЗ [3]. Анализ частоты нестабильных хромосомных аберраций был осуществлен у двух групп населения, пострадавшего от чернобыльской аварии. В первую группу вошло 229 детей, проживающих в Калужской области, для которых имелись данные прямых измерений доз излучения радиойода в щитовидной железе. Вторая группа включала детей (521), проживающих в Брянской области на территориях с различным уровнем загрязнения радионуклидами (в среднем от 147 до 955 кБк/м). У 8 человек была изучена также частота стабильных хромосомных аберраций. Следует отметить основные выводы, которые легли в основу даль- нейшего развития дозиметрического направления цитогенетических исследований в программе АЙФЕКА. Эти выводы следующие:

• -    через 6 лет после аварии частота нестаби льных аберраций - дицентриков и циклических колец - у детей с облученной щитовидной же лезой , а также у тех , которые проживают на за грязненных радионуклидами территориях , выше чем аналогичные показатели у детей адекватных контрольных групп ;

• -    не обнаружено корреляции между величиной дозы в щитовидной железе ( в диапазоне 0-5 Гр ) и частотой нестабильных аберраций ;

• -    частота нестабильных аберраций у обследо ванных лиц коррелирует с уровнем загрязнения территорий ¹³⁷Cs;

• -    исследование частоты нестабильных и , осо бенно , стабильных хромосомных аберраций явля ется перспективным в плане возможной ретро спективной оценки доз цитогенетическими мето дами .

Таблица

Оборудование , направленное ВОЗ в Белоруссию , Россию и Украину для проведения цитогенетических исследований в рамках АЙФЕКА

Оборудование	Ввод в действие	Место установки
Цитоскан	1992	МРНЦ РАМН , Обнинск , Россия
Цитовижин	1995	Институт генетики , Минск , Белоруссия
Цитовижин	1995	НЦРМ , Киев , Украина

Как было отмечено выше , пилотные проекты АЙФЕКА практически завершились в 1994 году . В связи с этим Руководящий программный комитет принял решение о включении в программу новых проектов , которые бы базировались на опыте и результатах исследований , полученных на пилот ной фазе .

В настоящее время АЙФЕКА включает 3 про екта :

• -    " Реконструкция дозы ";

• -    " Ликвидатор ";

• -    " Международный проект “ Щитовидная же леза ".

Как видно , дозиметрические исследования в постпилотную фазу АЙФЕКА выделены в са мостоятельный проект " Реконструкция дозы ". Его основной целью является разработка ре комендаций по общим подходам и соответст вующей технологии для реконструкции инди видуальных и / или групповых доз внешнего и внут реннего облучения с тем , чтобы были созданы совместимые базы дозиметрических данных , ко торые могли бы быть использованы в эпидемио логических исследованиях для изучения радиаци онного риска в результате чернобыльской аварии .

Специфическими задачами проекта " Рекон струкция дозы " являются следующие :

• -    обзор имеющихся дозиметрических све дений в существующих базах данных и оценка их качества ,

• -    выявление провалов знаний в области до зиметрии , имеющей отношение к чернобыльской аварии ,

• -    рекомендация подходящей и эффективной дозиметрической методологии для ретроспе ктивной оценки облучения ,

• -    создание общей формы и методологии формирования дозиметрической базы данных ,

• -    разработка технологии реконструкции ин дивидуальных доз внешнего и внутреннего об лучения , включая спецификацию неопределенно стей ,

• -    реконструкция индивидуальной дозы у па циентов с лейкозом , раком щитовидной железы и другими болезнями , представляющими интерес для эпидемиологических исследований .

Цитогенетические исследования в проекте " Ре конструкция дозы " рассматриваются как не отъемлемый компонент комплексного подхода к реконструкции доз , включающего физическую и биологическую дозиметрию , а также специальное дозиметрическое расследование на основе спе циального опросника . В протоколе проекта " Ре конструкция дозы ", разработанного специалиста ми Белоруссии , России и Украины при участии международных экспертов и ВОЗ , отмечается , что анализ стабильных транслокаций в лимфоцитах с использованием метода FISH является одним из потенциальных подходов к расширению совре менных знаний о накопленной дозе радиации у населения , пострадавшего вследствие аварии в Чернобыле .

Основная цель проекта "Ликвидатор" состоит в оказании помощи национальным органам здравоохранения в улучшении диагностики, лечения и реабилитации лиц, принимавших участие в ликвидации последствий аварии в Чернобыле. Проект включает эпидемиологический и клинический раз- делы. Несмотря на гуманитарный характер данного проекта, в нем предусмотрено выполнение задач, направленных на расширение научного знания в области биологических эффектов малых доз радиации, индикаторов радиационного воздействия на организм, оценки радиационного риска, сравнительного изучения различных методов биологической дозиметрии и других аспектов фундаментальной радиобиологии и радиационной медицины. В связи с этим стандартный протокол проекта, разработанный международными экспертами, включая представителей трех пострадавших от аварии государств и ВОЗ, включает широкий спектр клинических и лабораторных исследований, в том числе и цитогенетических. В частности, предусмотрены следующие тесты:

• -    анализ хромосомных аберраций в лимфо цитах и клетках костного мозга ;

• -    анализ микроядер в лимфоцитах ;

• -    проточная цитометрия ДНК ;

• -    исследование соматических мутаций .

В рамках проекта " Ликвидатор " выполняется субпроект " Оксидативный стресс у ликвидаторов . Профилактика оксирадикал - зависимых заболева ний антиоксидантами ". В этом субпроекте приме няются цитогенетические подходы к определению кластогенных факторов в плазме ликвидаторов . В настоящее время идентифицированы отдельные компоненты кластогенных факторов ( рисунок ). Они , в частности , включают продукты перекисного окисления липидов , цитокины , особенно фактор некроза опухоли , необычные нуклеотиды , в ко торых аденин деаминируется в гипоксантин . Эти компоненты , освобождающиеся клетками под воз действием супероксидных радикалов , стимулиру ют компетентные клетки , такие как моноцитарные макрофаги и нейтрофилы , к дальнейшей продук ции супероксидных радикалов . В результате этого развивается оксидативный стресс , при котором постоянно образующиеся свободные оксирадика лы вызывают генотоксические эффекты . Образо вание кластогенных факторов не является специ фическим признаком радиационного поражения . Аналогичная ситуация характерна для многих хро нических заболеваний . I.Emerit [6] из университета Пьера и Марии Кюри , Париж , Франция разработа ла тест определения кластогенных факторов в плазме ликвидаторов по их способности вызывать хромосомные аберрации в лимфоцитах доноров ( С Р-test, clastogenic factor test). На первом сове щании экспертов ВОЗ ( Париж , 20-21 сентября 1996 г .), посвященном проблеме оксидативного стресса у ликвидаторов , были представлены дан ные об увеличении у ликвидаторов уровня класто генных факторов , изученных вышеописанным ме тодом ( Н . Оганесян и соавт ., А . Никифоров и соавт ., I.Emerit). В других докладах ( Ю . Антипкин и соавт .,

А . Цыб и соавт ., О . Пятак и соавт ., А . Шефель ) со общалось о высоком уровне у ликвидаторов про дуктов перекисного окисления липидов и низком уровне антиоксидантной активности , т . е . приводи лись косвенные свидетельства наличия у них внутренних условий для образования кластоген ных факторов . Использование в качестве профи лактических средств различных антиоксидантов сопровождалось уменьшением уровня кластоген ных факторов у ликвидаторов и улучшением кли нического состояния .

На вышепоименованном совещании экспертов были разработаны стандартизованные подходы к дальнейшим кооперативным исследованиям кла стогенных факторов и оксидативного стресса у ликвидаторов , а также клинических испытаний различных антиоксидантов для отбора наиболее эффективных из них и последующего включения в комплекс реабилитационного лечения .

" Международный проект “ Щитовидная железа ", выполняемый в настоящее время в рамках про граммы АЙФЕКА , представляет собой продолже ние пилотного проекта " Щитовидная железа ". Его основной целью является изучение причины рез кого увеличения числа рака щитовидной железы у жителей загрязненных радионуклидами террито рий , особенно у тех , кто был ребенком в момент аварии . Одним из подходов для достижения этой цели является изучение генетической предраспо ложенности к радиационно - индуцированному раку щитовидной железы , которая , возможно , связана с нарушением механизма репарации ДНК . Для того чтобы проводить хорошо координированные ис следования по этиологии радиогенного рака щи товидной железы в рамках данного проекта , ВОЗ основал сеть сотрудничающих центров , которые базируются в профильных научных учреждениях Англии , Белоруссии , Германии , Италии , Польши , Франции , Швейцарии , Швеции и Японии . Кроме того , в проекте участвуют специализированное учреждение ВОЗ - Международное агентство по исследованию рака ( МАИР ) и Европейский центр по окружающей среде . Для этой же цели ВОЗ со вместно с Европейской комиссией , Медицинским фондом имени Сасакавы и Национальным инсти тутом здоровья , США инициировал переговоры по созданию Международного банка тканей рака щи товидной железы , который явился бы центром для верификации диагноза , обучения специалистов и выполнения научных исследований .

Таким образом , цитогенетические исследо вания на уровне хромосом и ДНК занимают важ ное место в программе ВОЗ по изучению ме дицинских последствий чернобыльской аварии . Их выполнение , как и всей программы АЙФЕКА , в значительной степени зависит от достаточности внебюджетного финансирования .

ПОВРЕЖДАЮЩИЙ ФАКТОР (РАДИАЦИЯ, ИНФЕКЦИЯ и др.)

ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС (ДЕПРЕССИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ И СТИМУЛЯЦИЯ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ)

ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ ОКСИРАДИКАЛОВ

ХРОМОСОМНЫЕ АБЕРРАЦИИ

Рис . Формирование оксидативного стресса после радиационного воздействия .

ВОЗ предпринимает все усилия к тому , чтобы АЙФЕКА нашла финансовую поддержку как со стороны правительств трех наиболее пострадав ших от аварии стран - Белоруссии , России и Ук раины , так и правительств других государств и отдельных доноров .

Реализации этих усилий в значительной степе ни способствует Резолюция ВОЗ 49.22, принятая Всемирной ассамблеей здравоохранения 25 мая 1996 года , которая призывает все страны - члены ВОЗ ( их около 200) к активному участию в Между народной программе по уменьшению медицинских последствий аварии на Чернобыльской АЭС и ее дальнейшей поддержке , включая финансовую помощь .